利用大腸桿菌C4途徑合成5-氨基乙酰丙酸.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(ALA)作為所有吡咯化合物（例如血紅素、維生素B12、葉綠素）的前體物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。農(nóng)業(yè)上，ALA促進(jìn)光合作用和組織分化，能夠選擇性殺死雙子葉植物的雜草而對(duì)農(nóng)作物無害，增強(qiáng)植物的抗寒性和耐鹽性;醫(yī)學(xué)上，作為光動(dòng)力學(xué)藥物，在診斷和治療癌癥方面效果顯著，在霉菌病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病治療中的作用逐步被認(rèn)可，對(duì)美容和護(hù)膚也有一定功效，具有很好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和工業(yè)前景。
　　傳統(tǒng)的ALA化學(xué)合成法

2、成本高、收率低、價(jià)格昂貴且造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。生物合成法合成ALA具有生產(chǎn)過程簡單、生產(chǎn)潛力大且對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)。ALA的生物合成主要有兩條途徑:一條C5途徑，由本實(shí)驗(yàn)室首次構(gòu)建，以葡萄糖為唯一碳源在大腸桿菌中發(fā)酵生產(chǎn)ALA，但該途徑涉及的酶較多，代謝調(diào)控復(fù)雜，且產(chǎn)量提高有難度;另一條是C4途徑，以琥珀酰-CoA和甘氨酸為前體，由于其途徑較短，調(diào)控簡單而被廣泛研究。然而昂貴的前體物質(zhì)琥珀酰-CoA和甘氨酸的添加、好氧發(fā)酵過程對(duì)通氣量

3、和攪拌的較高要求使得生產(chǎn)成本較高。如何對(duì)C4途徑進(jìn)行優(yōu)化，從而提高ALA產(chǎn)量和產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本成為本論文研究的重點(diǎn)。
　　本論文首先在好氧條件下對(duì)C4途徑進(jìn)行了優(yōu)化，包括選取不同遺傳背景的大腸桿菌進(jìn)行好氧發(fā)酵，比較其ALA生產(chǎn)能力及菌株代謝的不同;在提高溶氧條件下對(duì)不同遺傳背景菌株的ALA生產(chǎn)能力進(jìn)行比較;進(jìn)一步對(duì)不同來源ALA合酶的篩選優(yōu)化。結(jié)果表明不同遺傳背景的大腸桿菌菌株生產(chǎn)ALA的能力差別較大，生長情況也有很大不同;在能

4、同時(shí)分解脂肪酸和葡萄糖的KNSP菌株中表達(dá)來源于紅假單胞菌KUGB306的ALA合酶時(shí)，搖瓶發(fā)酵ALA產(chǎn)量達(dá)到3.61g/l，且該菌株生長較好，活力旺盛。本部分研究首次清晰地證實(shí)了利用重組大腸桿菌生產(chǎn)ALA的能力依賴于所選用的菌株背景，不同基因型的大腸桿菌由于代謝通量不同，ALA合酶的活力不同，ALA向下游轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)也不盡相同，從而導(dǎo)致ALA產(chǎn)量有較大差別。
　　本論文進(jìn)一步在大腸桿菌中建立了微好氧和好氧-厭氧雙階段發(fā)酵生產(chǎn)ALA

5、的策略。利用本實(shí)驗(yàn)室已有的好氧-微好氧-厭氧琥珀酸高產(chǎn)菌YL106，該菌株能夠積累大量琥珀酸，且副產(chǎn)物如乳酸、乙酸等很少，進(jìn)而為ALA的生產(chǎn)提供豐富的前體，通過表達(dá)來源于類球紅桿菌的ALA合酶得到Y(jié)L106A菌株，該菌株微好氧搖瓶條件下能夠積累5.88 g/l ALA，產(chǎn)率為0.557 g ALA/g glucose，將該菌株進(jìn)行5L罐發(fā)酵優(yōu)化，ALA產(chǎn)量達(dá)到7.67 g/l;為驗(yàn)證由琥珀酸向琥珀酰-CoA轉(zhuǎn)化是否限速，嘗試在該菌中過表

6、達(dá)cat1或sucCD，發(fā)現(xiàn)cat1的過表達(dá)能夠明顯提高微好氧下ALA產(chǎn)率和生產(chǎn)速率，利用該菌進(jìn)行低溶氧發(fā)酵有望降低通氣和攪拌的生產(chǎn)成本，簡化下游分離提取工藝。
　　本論文最后一部分嘗試以葡萄糖為唯一碳源合成前體琥珀酸和甘氨酸，最終實(shí)現(xiàn)由葡萄糖直接合成ALA，以降低C4途徑生產(chǎn)成本。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的絲氨酸產(chǎn)生菌能夠積累一定量的絲氨酸（4.5g/l），且流向甘氨酸的通量較大，而甘氨酸是ALA合成的兩種前體之一。進(jìn)一步在絲氨酸產(chǎn)生菌

7、3Sp中敲除sucD，使得另一種前體琥珀酸不需外源添加。然后通過過表達(dá)ALA合酶，實(shí)現(xiàn)ALA的積累。同時(shí)我們還探究了不同來源的ALA合酶對(duì)ALA積累能力的影響，并且優(yōu)化了絲氨酸合成途徑相關(guān)的輔因子，如葉酸、磷酸吡哆醛、谷氨酸，最終得到一株大腸桿菌工程菌5SRPO，該菌株無需添加任何前體，以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，搖瓶下能夠積累約0.21g/l的ALA。該部分首次建立了以葡萄糖為唯一碳源的ALA發(fā)酵策略，擺脫了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)琥珀酸和甘氨酸前體的