5-氨基乙酰丙酸高效表達體系的建立及其應(yīng)用.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)，是四吡咯類化合物(例如：亞鐵血紅素、卟啉、葉綠素和維生素B<,12>)的共同前體，也是調(diào)節(jié)四吡咯類物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵代謝中間物，廣泛存在于微生物、植物和動物細胞中。近年來，發(fā)現(xiàn)ALA在農(nóng)業(yè)上可用作殺蟲劑、除草劑、病毒病制劑及生長調(diào)節(jié)因子；在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，ALA作為第二代光動力藥物，可用于治療各種癌癥，且副作用小、療效確切。因此對ALA的工業(yè)化生產(chǎn)引起了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的重

2、視。 本文從嗜酸芽生紅細菌 Rhodoblastus acidophilus 中克隆得到了ALA合成酶基因，構(gòu)建了高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌，通過對工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化，大幅度提高了ALA的產(chǎn)量。將胞外ALA應(yīng)用于作物，發(fā)現(xiàn)外源ALA能有效提高作物體內(nèi)葉綠素含量及干物質(zhì)重，同時提高了作物的抗逆性。 研究工作的主要創(chuàng)新點和進展包括： 1.根據(jù)本實驗室已報道R.acidophilus的ALAS基因(Genebank

3、 登勻之號：DQ288861) 序列，設(shè)計分別帶有SacⅠ和HindⅢ酶切位點的上下游引物 ALAS-FOR和 ALAS-REV，克隆了大小為1267bp的ALAS目的基因片段；將目的基因與表達載體 pQE30 分別經(jīng) SacⅠ和 HindⅢ雙酶切后連接，構(gòu)成了原核表達載體ALAS-pQE30。將表達載體分別轉(zhuǎn)化E. coli JM109、M15和BL21(DE3)菌株，通過比較3個重組菌ALA合成酶比活力及積累ALA的能力，確定重組菌

4、E.coliM15 (ALAS-pQE30)為優(yōu)勢菌株。 2.以重組菌 E.coli M15(AIAS-pQE30)為研究對象，對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，包括誘導(dǎo)劑、底物及抑制劑的添加量、添加時間及添加方式，同時研究了間歇式的向搖瓶中補加培養(yǎng)基能增大胞外濃度，經(jīng)發(fā)酵放大的E.coli M15(ALAS-pQE30)過夜培養(yǎng)后胞外ALA積累量達到5.3791g·L<'-1>。 3.將發(fā)酵液采取高溫處理或SDS變性后，低溫保存

5、能降低ALA的降解。且1％SDS處理的效果最明顯，在-20℃保存時，25d內(nèi)降解的ALA只有24％，4℃保存時也只降解29％。 4.用M15(ALAS-pQE30)發(fā)酵液上清處理煙草和辣椒，能有效提高體內(nèi)葉綠素含量，同時葉片的比葉重得到很大提高，即外源ALA能提高植物的光合作用質(zhì)量、增加作物產(chǎn)量。而且經(jīng)外源ALA處理后的煙草經(jīng)霜凍與干旱脅迫后，其體內(nèi)POD和CAT活性提高，而MDA含量降低，證明外源ALA能明顯提高煙草的抗逆性。