生物素前體物：庚二酸在重組枯草芽孢桿菌中的高效合成.pdf

1、生物素(vitamin H)是動物機體維持正常生理機能所必需的B族維生素之一，在畜牧業(yè)、食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域應用廣泛。我國所用的生物素大部分從美國、同本等國家進口，價格昂貴。因此，有必要進行生物素合成研究。由于化學法生產(chǎn)的高污染性，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物素成為國際上高技術(shù)競爭的又一熱點。而枯草芽孢桿菌作為一種優(yōu)秀的基因工程菌成為生產(chǎn)生物素的首選。 庚二酸是枯草芽孢桿菌生物素合成前體物之一，在發(fā)酵生產(chǎn)過程中通常被添加到發(fā)酵液中來提高生

2、物素產(chǎn)量，但其高價格和添加帶來的環(huán)境污染問題限制了它的應用，成為發(fā)酵生產(chǎn)生物素過程中一個亟待解決的問題。通過基因重組來提高枯草芽孢桿菌自身庚二酸的產(chǎn)量就成了解決這個難題的唯一出路。在庚二酸合成基因方面人們做了大量的研究，現(xiàn)一致認為枯草芽孢桿菌生物素操縱子中的biol-orf2基因序列與庚二酸合成密切相關(guān)。而orf3這個功能未知基因與該序列同處在一個獨立的操縱元上，推測可能對庚二酸的合成起輔助作用。 影響克隆基因表達效率的因素有2

3、個：第一是啟動子強度；第二是基因拷貝數(shù)，但由于克隆質(zhì)粒在枯草芽孢桿菌中存在復制不穩(wěn)定及表達外源基因效率低等現(xiàn)象，將外源目的基因整合到染色體上復制表達成為解決這些問題的有效策略。本研究以枯草芽孢桿菌PY79菌株為研究材料，將強麥芽糖啟動子P<,glv>及氯霉素基因連接到bioI-orf2-orf3順反子上游，然后通過同源重組整合到枯草芽孢桿菌染色體上。通過增加整合序列的拷貝數(shù)，最終增加庚二酸合成量。 設(shè)計引物Cm-up/Cm-do

4、wn和Cobiol-up/Cobio2-down，分別以質(zhì)粒pGJ103和枯草芽孢桿菌168基因組DNA為模板，PCR擴增氯霉素基因(～1.0 kbp)和bioI-orf2-orf3順反子序列(～2.8 kbp)，純化的PCR產(chǎn)物分別克隆入pGEM-T和pBluskm載體中產(chǎn)生質(zhì)粒pLHX1和pLHX2。然后將pLHX2中的EcoRI-XbaI限制性內(nèi)切酶片段(BioI-orf2-orf3，2.8kbp)與pGJ113中的ApaI-Ec

5、oRI片段(P<,glv>，300 bp)相連接并克隆入pGEM-T載體中相應的酶切位點，產(chǎn)生pYG57。將pLHXl中氯霉素基因片段連入pE3載體中產(chǎn)生pUtX5。最后將pYG57中XbaI-Anal片段(P<,glv>-biol-orf2-orf3)插入pLHX5中產(chǎn)生整合載體pLHX8。 所有的連接產(chǎn)物都以電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中擴增。由于pI.HX8中的biol-orf2-orf3序列與枯草芽孢桿菌。PY7

6、9基因組生物素操縱子序列同源，通過單交叉整合方式將pLHX8滾環(huán)式帶入PY79染色體，形成BpLHX8。PCR初篩，正確整合子通過高氯霉素抗性(50μg/ml)擴增整合序列拷貝數(shù)，通過Southem blotting可檢測到4～5個拷貝。通過反相高效液相色譜法測定了發(fā)酵液體中庚二酸的含量。試驗結(jié)果表明，將P,-bilI-orf2-orf3順反子序列整合到宿主菌染色體，通過氯霉素抗性提高整合序列拷貝數(shù)以及麥芽糖誘導表達，提高了庚