羊種布魯氏菌外膜蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡分子機制.pdf

1、布魯氏菌（Brucella，簡稱布魯菌）是一種胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性病原菌，能夠引起一種世界范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患傳染病——布氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將布病歸為B類重要傳染病，我國也將該疾病列為乙類傳染病。
　　布魯菌能在巨噬細(xì)胞(macrophages)、樹突狀細(xì)胞(DCs)和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞液泡中寄生并大量繁殖，主要的入侵途徑分為五個步驟:黏附、內(nèi)生化、侵入、存活和復(fù)制。布魯菌進入宿

2、主細(xì)胞后，其獨特的胞內(nèi)生存方式，如將菌體和抗體隔離，使抗體無法發(fā)揮作用，用以逃避宿主先天性免疫和獲得性免疫應(yīng)答，進而驅(qū)動了布魯菌獨有的病理學(xué)狀態(tài):侵入并在宿主組織中傳播最終長期存在于宿主體內(nèi)造成慢性感染，引起嚴(yán)重的器官損傷，甚至可能導(dǎo)致宿主生物死亡。TLRs(Toll-like receptors)主要表達于免疫系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表面，可以通過識別表達在細(xì)菌、病毒和真菌組成物上廣譜的病原體相關(guān)分子模式(P

3、AMPs)，啟動宿主抗感染的天然免疫應(yīng)答的炎癥反應(yīng)。
　　TLR2和TLR4都參與了B.abortus感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，熱滅活的B.abortus(HKBA)通過TLR2誘導(dǎo)細(xì)胞表達TNF-α和IL-6。已有研究證明布魯菌，LPS并不是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因素，然而布魯菌脂蛋白作為TLR2的配體，具有刺激內(nèi)源性炎癥因子表達的能力，但只有L-OMP16和L-OMP19能誘導(dǎo)TNF-α、 IL-6、IL-10和IL-12的分泌，并存在時間

4、和劑量依賴性，而U-OMP16和U-OMP19并不具有這個能力。同時，布魯菌脂蛋白L-OMP19能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子、IL-6以及粘附分子等。HKBA和L-OMP19可以通過TNF受體1(TNFR)誘導(dǎo)小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和增殖，促進IL-6、IL-1β、TNF-α、 MCP-1和KC分泌。很多研究證明OMPs既是免疫保護抗原，同時又能與毒力基因相互作用，故而很多有關(guān)細(xì)菌致病機制和免疫反應(yīng)機制的研究都集中在OMPs的研究上。巨噬

5、細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞都是布魯菌的主要宿主細(xì)胞，然而，對布魯菌如何在吞噬細(xì)胞中進行持續(xù)性繁殖以及病原體-宿主的相互關(guān)系知之甚少。究竟布魯菌哪些OMPs能與天然免疫TLR信號通路中介質(zhì)信號蛋白發(fā)生互作，參與TLR信號通路的負(fù)調(diào)控機制，使布魯菌長期在巨噬細(xì)胞或胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)生存？另外，布魯菌感染后可導(dǎo)致宿主細(xì)胞兩種截然相反的命運:一是引起機體的免疫耐受、抗凋亡;二是引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)。在這兩種情況中，外膜蛋白扮演何種角色，如何發(fā)揮作

6、用尚未可知，尤其脂蛋白OMP19和OMP16不同表現(xiàn)形式在布魯菌感染細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能和作用機制也未明確。
　　目的:
　　本文旨在研究布魯菌外膜蛋白與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和/或胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡的關(guān)系及其作用機制，發(fā)現(xiàn)與外膜蛋白相互作用的胞內(nèi)信號通路蛋白，為進一步揭示布魯菌侵染細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用的可能毒力因子，通過了解布魯菌的胞內(nèi)生存途徑的分子機制及特點，能夠為布病的預(yù)防和控制提供借鑒。
　　方法:
　　(1)羊種布

7、魯菌脂蛋白的制備:利用PCR技術(shù)從布魯菌疫苗株M5-90的基因組中調(diào)取布魯菌脂蛋白U-OMP19、L-OMP16、U-OMP16、L-OMP10和U-OMP10的基因。插入原核表達載體pET-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒并進行表達，SDS-PAGE、WB鑒定表達情況。分別進行包涵體溶解、復(fù)性與鎳柱純化。
　　(2)羊種布魯菌外膜蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實驗:羊種布魯菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L-OMP19、U-OMP19

8、、L-OMP16、U-OMP16和U-OMP10，分別孵育Huh7.5.1人肝癌細(xì)胞、JEG-3人絨毛膜癌細(xì)胞、未活化的THP-1人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞和經(jīng)1，25(OH)2D3活化的THP-1細(xì)胞，收集孵育24小時、48小時和72小時后的細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測體外刺激細(xì)胞凋亡情況。
　　(3)羊種布魯菌外膜蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子:羊種布魯菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L-OMP19、U-OMP19、L-OMP

9、16、U-OMP16和U-OMP10，分別孵育Huh7.5.1細(xì)胞、JEG-3細(xì)胞、未活化的THP-1細(xì)胞和經(jīng)1，25(OH)2D3活化的THP-1細(xì)胞，收集孵育24小時、48小時和72小時后的細(xì)胞培養(yǎng)上清，通過ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中CXCL、MCP-1、IL-6、IL-8、TNF-α以及IL-1β的表達情況。
　　(4)與THP-1細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白篩選:收集羊種布魯菌脂蛋白L-OMP19、U-OMP19、L-OMP1

10、6、U-OMP16和U-OMP10孵育活化的THP-1細(xì)胞72h后的沉淀，進行細(xì)胞裂解，并用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度后，送RayBiotech公司進行凋亡蛋白質(zhì)芯片的檢測分析。
　　結(jié)果:
　　(1)制備羊種布魯菌脂蛋白:從M5-90疫苗株基因組中，擴增獲得L-OMP10和U-OMP10的基因產(chǎn)物片段大小約為381bp及324bp，L-OMP16和U-OMP16的基因產(chǎn)物片段大小約為507bp及435bp，U-OMP

11、19的基因產(chǎn)物片段大小約為510bp，基因測序結(jié)果正確。將測序正確的基因序列翻譯為氨基酸序列后，分別分析L-OMP10與U-OMP10，L-OMP16與U-OMP16，L-OMP19與U-OMP19之間氨基酸序列差異，確定OMP10、OMP16、OMP19的序列存在細(xì)菌脂蛋白前體:氨基末端信號肽以一個四肽序列結(jié)束，符合前脂蛋白剪切與加工所需的共有序列。重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達后，除了L-OMP10其余蛋白均成功表達。U-OMP10蛋白分子大小

12、約15kDa，L-OMP16和U-OMP16蛋白分子大小約18kDa和17kDa，U-OMP19蛋白分子大小約23kDa。包涵體洗滌溶解后進行復(fù)性，分泌蛋白用鎳柱進行純化。采用針對His標(biāo)簽的抗體檢測蛋白表達，Western Blot顯示蛋白大小與預(yù)期一致。
　　(2)羊種布魯菌外膜蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡:流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，羊種布魯菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L/U-OMP19、L/U-OMP16和U-OMP10，

13、不能誘導(dǎo)Huh7.5.1人肝癌細(xì)胞和JEG-3人絨毛膜癌細(xì)胞的凋亡。除布魯菌非脂化蛋白U-OMP16以外，其他布魯菌外膜蛋白均不能誘導(dǎo)未活化的THP-1人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡。U-OMP16誘導(dǎo)未活化的THP-1細(xì)胞凋亡具有時間依賴性，凋亡率隨著刺激時間的增加升高，而且不受蛋白污染物的影響。
　　流式細(xì)胞檢測羊種布魯菌外膜蛋白誘導(dǎo)活化THP-1細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，只有U-OMP16、L-OMP16和U-OMP10在24h后開

14、始表現(xiàn)出促凋亡的作用，且細(xì)胞凋亡率隨著時間的推移而增加，尤其U-OMP16誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的作用最強;BP26和U-OMP19在48小時表現(xiàn)出誘導(dǎo)活化THP-1細(xì)胞凋亡的能力，但72h時BP26誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率可達26％;而L-OMP19卻在72小時后才開始表現(xiàn)出較弱的誘導(dǎo)活化THP-1細(xì)胞凋亡的能力;OMP31和OMP25則完全不具備誘導(dǎo)活化THP-1細(xì)胞凋亡的能力。
　　(3)羊種布魯菌外膜蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況

15、:U-OMP16能誘導(dǎo)未活化THP-1細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、CXCL、MCP-1、IL-1β和IL-8。其中IL-8和TNF-α表達水平隨時間增加而降低，其余細(xì)胞因子IL-6、CXCL、MCP-1和IL-1β的表達升高，MCP-1和IL-1β在48小時后表達開始下降。THP-1細(xì)胞經(jīng)1，25(OH)2D3活化后能低水平分泌MCP-1，而且在羊種布魯菌外膜蛋白孵育細(xì)胞后能上調(diào)該因子的表達。BP26、L-OMP19和U-OMP19僅

16、誘導(dǎo)活化THP-1細(xì)胞分泌低水平的TNF-α、IL-1β和IL-6。L/U-OMP16和U-OMP10誘導(dǎo)活化THP-1分泌較高水平的TNF-α、IL-1β和IL-6。而且，羊種布魯菌外膜蛋白刺激活化THP-1細(xì)胞，細(xì)胞因子MCP-1、TNF-α、IL-1B和IL-6的表達水平，隨著孵育時間的增加沒有顯著性的變化。
　　結(jié)論:
　　(1)制備了U-OMP10、L/U-OMP16和U-OMP19的原核表達重組蛋白。
　　

17、(2)通過流式檢測發(fā)現(xiàn)布魯菌外膜蛋白OMP31、BP26、OMP25、L/U-OMP19、L/U-OMP16和U-OMP10不具備誘導(dǎo)Huh7.5.1細(xì)胞和JEG-3細(xì)胞凋亡的能力。
　　(3)除OMP31和OMP25外，其余6種外膜蛋白(BP26、L/U-OMP19、L/U-OMP16和U-OMP10)均能誘導(dǎo)活化THP-1細(xì)胞凋亡，并促進炎癥因子的表達，其中U-OMP16的作用最強。因此，OMP16可能是參與布魯菌感染誘導(dǎo)細(xì)胞