羊種布魯氏菌對(duì)巨噬細(xì)胞MHCII表達(dá)和遞呈的影響.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis，簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌屬(Brucella)的布魯氏菌引起的一種古老的人畜共患傳染病病，該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全，并造成畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)巨大損失。巨噬細(xì)胞是布魯氏菌感染宿主后的首要靶細(xì)胞，巨噬細(xì)胞不僅是宿主體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，也是一種重要的抗原遞呈細(xì)胞，在清除病原菌、分泌多種細(xì)胞因子和對(duì)抗原的識(shí)別、活化以及免疫調(diào)節(jié)中扮演著重要的角色，國(guó)內(nèi)外己經(jīng)有一些研究表明布魯氏菌感染宿主后具有明顯的

2、免疫抑制作用，能夠抑制 MHC II分子的功能，然而，其相關(guān)原因尚不明確。本文主要研究布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞后引起的非典型自噬對(duì) MHC II類分子的影響以及布魯氏菌誘導(dǎo)非典型自噬的可能因素，為研究布魯氏菌免疫抑制提供新的思路和方法。
　　1.布魯氏菌16M誘導(dǎo)的非典型自噬對(duì)巨噬細(xì)胞 MHC II表達(dá)和遞呈的影響。以0.25 ng/mL IFN-γ處理的小鼠巨噬細(xì)胞、布魯氏菌16M侵染0.25 ng/mL IFN-γ處理的小鼠巨噬細(xì)

3、胞為實(shí)驗(yàn)組，以未處理細(xì)胞為對(duì)照組，分別作用0 h、4 h、12 h、24 h，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)胞內(nèi) MHC II類分子的轉(zhuǎn)錄水平；以布魯氏菌16M侵染0.25 ng/mL IFN-γ處理過的小鼠巨噬細(xì)胞，16M侵染0.25 ng/mL IFN-γ處理的穩(wěn)定表達(dá) Atg5、Atg7的GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞為對(duì)照組，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) MHC II轉(zhuǎn)錄水平，激光共聚焦

4、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬小體和溶酶體的融合率，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面 MHC II類分子平均熒光強(qiáng)度和 OMP31平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果，與0.25 ng/mL IFN-γ處理組相比，布魯氏菌16M侵染0.25 ng/mL IFN-γ處理的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞，MHC II分子 mRNA水平極顯著下降（p<0.01）；布魯氏菌侵染穩(wěn)定表達(dá) Atg5和 Atg7的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi) MHC II類分子mRNA水平差異不顯著

5、(p>0.05)，但自噬小體和溶酶體的融合率升高，細(xì)胞表面 MHC II類分子表達(dá)量顯著升高（p<0.01）且對(duì) OMP31遞呈能力顯著升高（p<0.01）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明布魯氏菌16M抑制了 IFN-γ誘導(dǎo)的 MHC II mRNA表達(dá)水平；GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)自噬相關(guān)蛋白 Atg5和 Atg7，沒有改變布魯氏菌16M對(duì) MHC II mRNA的抑制作用，但解除了布魯氏菌16M對(duì)自噬-溶酶體降解途徑的阻滯作用，并且顯著提高

6、了細(xì)胞表面 MHC II類分子的表達(dá)量和細(xì)胞遞呈能力。
　　2.布魯氏菌16M感染巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)非典型自噬的可能影響因素。以布魯氏菌16M侵染小鼠巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，未做任何處理的小鼠巨噬細(xì)胞為對(duì)照組，4 h、12 h、24 h、48h后，通過 ELISA抗體雙夾心方法檢測(cè)小鼠巨噬細(xì)胞上清液中 IL-6的含量；以布魯氏菌16M侵染0.25 ng/mL IFN-γ處理的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞、5 ng/mL IL-6和0.25 n

7、g/mL IFN-γ處理的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞、5 ng/mL IL-6處理的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，以布魯氏菌16M侵染未做任何處理的 GFP-LC3小鼠巨噬細(xì)胞為對(duì)照組，作用4 h，激光共聚焦觀察自噬小體標(biāo)志性蛋白 LC3的熒光顆粒；0.25 ng/mL IFN-γ、5 ng/mL IL-6分別作用于小鼠巨噬細(xì)胞0 min、15 min、30 min、60 min，及0.25 ng/mL IFN-γ和5 ng/

8、mL IL-6共同作用于小鼠巨噬細(xì)胞4 h，相對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白Atg5和 Atg7的表達(dá)量。結(jié)果布魯氏菌強(qiáng)毒株16M侵染小鼠巨噬細(xì)胞，IL-6細(xì)胞因子表達(dá)量相比對(duì)照組顯著升高（p<0.01）；且激光共聚焦檢測(cè)到 IFN-γ處理過的小鼠巨噬細(xì)胞自噬特異性標(biāo)簽 GFP-LC3的熒光顆粒數(shù)最多,當(dāng) IFN-γ的處理中同時(shí)加入 IL-6時(shí)，GFP-LC3的熒光顆粒數(shù)減少；相對(duì)熒光定量 PCR顯示隨時(shí)間增加，IFN-γ上調(diào)了 At

9、g7的表達(dá)量，當(dāng)作用30 min時(shí)差異顯著（P＜0.05），作用60 min時(shí)差異極顯著（P＜0.01），IFN-γ對(duì)Atg5的表達(dá)量沒有影響（P>0.05），而 IL-6下調(diào)了 Atg7的表達(dá)量，作用15 min時(shí)差異顯著（P＜0.05），作用30 min時(shí)差異極顯著（P＜0.01），IL-6降低了 Atg5的表達(dá)量，作用60 min時(shí)差異顯著（P＜0.05），當(dāng) IL-6與 IFN-γ共同作用4 h時(shí)，IL-6同樣表現(xiàn)出對(duì) Atg7

10、、Atg5表達(dá)量的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明布魯氏菌16M能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞分泌 IL-6，且 IL-6抑制了 IFN-γ誘導(dǎo)的典型自噬。
　　以上研究結(jié)果表明布魯氏菌16M抑制了 IFN-γ誘導(dǎo)的 MHC II mRNA表達(dá)水平；巨噬細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)自噬相關(guān)蛋白 Atg5、Atg7，沒有改變布魯氏菌16M對(duì) MHC II mRNA的抑制作用，但解除了布魯氏菌16M對(duì)自噬-溶酶體降解途徑的阻滯作用，并且顯著提高了細(xì)胞表面 MHC II類分