羊種布魯氏菌持續(xù)性感染巨噬細胞機制研究.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一類動物源性人獸共患病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其是發(fā)展中國家。近幾年回升勢頭迅猛。布魯氏菌主要毒力表現(xiàn)在能侵入宿主細胞并在其中生存增殖形成持續(xù)性感染的能力。布魯氏菌侵入宿主細胞后逃避與溶酶體融合以及抑制宿主細胞凋亡是其在胞內(nèi)形成持續(xù)性感染的重要原因，目前大量的研究表明自噬與凋亡及溶酶體融合降解途徑密切相關，布魯氏菌激活自噬途徑及其相關機制的研究尚不多見。
　　目的：本文以羊種布魯氏菌參考株16M（以下

2、簡稱16M）感染巨噬細胞為模型，研究布魯氏菌感染巨噬細胞后：（1）是否激活巨噬細胞自噬途徑。（2）自噬途徑的激活對羊種布魯氏菌胞內(nèi)生存繁殖的影響。（3）羊種布魯氏菌激活巨噬細胞的自噬對細胞凋亡的影響。（4）羊種布魯氏菌激活巨噬細胞自噬對溶酶體與布魯氏菌融合率的影響.探討布魯氏菌感染后激活自噬途徑與細胞凋亡之間的關系以及對溶酶體途徑的影響，揭示布魯氏菌在巨噬細胞內(nèi)持續(xù)性感染的分子機制，為布魯氏菌病新藥物研發(fā)、防治及家畜抗病育種工作奠定基礎

3、。
　　方法：（1）通過對自噬泡特異性標記物GFP-LC3陽性點數(shù)的統(tǒng)計以及研究自噬最經(jīng)典的方法電鏡技術來監(jiān)測羊種布魯氏菌16M（16M）侵染巨噬細胞后細胞自噬活性的變化。(2）16M侵染巨噬細胞后，利用自噬的抑制劑3-MA抑制細胞自噬或利用RNA干擾技術沉默自噬泡形成過程中的必需基因Beclin-l，檢測16M胞內(nèi)CFU；同時用MTT法檢測自噬抑制劑3-MA和Beclin-l干擾載體對巨噬細胞活性的影響.（3）用16M侵染小鼠巨

4、噬細胞RAW264.7后，利用自噬抑制劑3-MA干預巨噬細或用RNA干擾技術沉默自噬起始基因Belclin-1后，用流式細胞儀檢測巨噬細胞的凋亡率，用western-blot檢測巨噬細胞自噬被16M激活和被Beclin-1干擾質(zhì)粒抑制后Caspase-8,9激酶的活性變化以及細胞色素C的水平。（4）用可表達綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pWal-GFP電轉(zhuǎn)化布魯氏菌,將電轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pWal-GFP的布魯氏菌侵染溶酶體紅色熒光探針Lyso-Tracke

5、rRed標記的巨噬細胞,用激光共聚焦顯微鏡觀測布魯氏菌和溶酶體的共定位區(qū)域。
　　結果：（1）與未侵染16M的對照組相比，在16M侵染組中：激光共聚焦顯微鏡檢測到GFP-LC3陽性點數(shù)顯著增多（p<0.05）；電鏡檢測到典型的雙/多層膜自噬小體結構；western-blot檢測顯示自噬小體表面微管相關蛋白1的輕鏈3(LC3-II)的表達量顯著提高，LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化率在侵染12小時后達到最高水平。（2）在感染16M24

6、h，48h時，自噬抑制劑3-MA抑制細胞自噬后與對照組相比侵染組胞內(nèi)布魯氏菌數(shù)顯著降低（P<0.05）；RNA干擾技術沉默自噬泡形成過程中的必需基因Beclin-l后胞內(nèi)布魯氏菌數(shù)也顯著下（p<0.05）。MTT法檢測3-MA和RNA干擾質(zhì)粒均不影響細胞活性。（3）3-MA處理組巨噬細胞的凋亡率和Belclin-1干擾組的凋亡率均高于16M侵染組，并且差異性顯著（P<0.05）。自噬抑制劑的應用和自噬起始基因的沉默在降低細胞自噬的同時，

7、增強了細胞的凋亡比例；與16M侵染組相比Beclin-1干擾組細胞的Caspase-9的活性明顯上調(diào)，而Caspase-8的活性則沒有明顯改變；3-MA組和Beclin-1干擾組中，細胞色素C明顯高于16M侵染組。（4）胞漿中的紅色顆粒狀熒光即為溶酶體，綠色顆粒是布魯氏菌,二者存在共定位區(qū)域（黃色）.隨機選擇100個細胞(視野)統(tǒng)計胞內(nèi)黃色斑點數(shù),添加3-MA自噬抑制劑后胞內(nèi)黃色斑點數(shù)明顯增多（p<0.05）。.
　　結論：16M