流產(chǎn)布魯氏菌Omp25與L7-L12促巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、布魯氏菌病(簡(jiǎn)稱(chēng)布病)是國(guó)際公認(rèn)的自然疫源性疾病，可以在動(dòng)物群體中自然攜帶與傳播。布病以人、牛、羊、豬最為常見(jiàn)，犬及60多種家畜、家禽及野生動(dòng)物對(duì)布病都有不同程度的易感性。布病流行范圍很廣，全世界200多個(gè)國(guó)家和地區(qū)中有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有人及家畜布病的存在。全世界每年因布病造成的經(jīng)濟(jì)損失可高達(dá)30億美元。在我國(guó)，僅新疆和青海兩地每年布病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失近1億元。
　　 巨噬細(xì)胞是天然免疫的第一道防線(xiàn)，是布魯氏菌在體內(nèi)復(fù)制的主要

2、侵染細(xì)胞。對(duì)于布魯氏菌的存活和擴(kuò)散起著非常重要的作用。在布魯氏菌感染的早期，巨噬細(xì)胞有可能先通過(guò)降解布魯氏菌并提呈布魯氏菌抗原來(lái)啟動(dòng)免疫應(yīng)答，一旦此途徑受阻，感染的巨噬細(xì)胞便可能通過(guò)啟動(dòng)凋亡信號(hào)使布魯氏菌失去巨噬細(xì)胞提供的保護(hù)環(huán)境，便于機(jī)體將其清除。而事實(shí)上，布魯氏菌能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并且積極維護(hù)細(xì)胞免于發(fā)生凋亡。由此可見(jiàn)，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡對(duì)布魯氏菌的感染清除有著重要的意義。
　　 有研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子的分

3、泌與革蘭氏陰性菌的菌體蛋白有關(guān)。布魯氏菌外膜蛋白Omp25能調(diào)節(jié)TNF-α的產(chǎn)生，而TNF-α的產(chǎn)生能夠限制或清除巨噬細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌；L7/L12蛋白是布魯氏菌的核糖體蛋白，能促進(jìn)γ干擾素(IFN-γ)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，而IFN-γ表達(dá)上調(diào)與巨噬細(xì)胞凋亡直接相關(guān)。因此，本研究以O(shè)mp25、L7/L12為靶蛋白，體外研究Omp25、L7/L12蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響。
　　 本研究克隆出流產(chǎn)型布魯氏菌omp25基因和L7/L12基因。

4、將omp25連入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，L7/L12連入原核表達(dá)載體pET28a-SUMO，表達(dá)重組蛋白pGEX-6p-omp25和pET28a-SUMO-L7/L12。制備鼠抗Omp25多克隆抗體和兔抗L7/L12多克隆抗體。將omp25和L7/L12分別插入轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTB的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞(sf9)中表達(dá)。
　　 蛋白體外作用巨噬細(xì)胞，對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬活性、分泌的細(xì)胞因子

5、、促細(xì)胞凋亡方面進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果：
　　 1)Omp25和L7/L12對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響
　　 巨噬細(xì)胞分別負(fù)載Omp25和L7/L12后，吞噬活性與靜息狀態(tài)相比差異顯著(P<0.01)，與陰性對(duì)照相比，差異顯著(P<0.01)，Omp25與LPS協(xié)同作用后，巨噬細(xì)胞吞噬活性顯著提高，與巨噬細(xì)胞負(fù)載Omp25后的吞噬活性相比，差異顯著(P<0.01)；L7/L12與LPS協(xié)同作用后，巨噬細(xì)胞吞噬活性顯著提高，與巨噬

6、細(xì)胞負(fù)載L7/L12后的吞噬活性相比，差異顯著(P<0.01)。
　　 2)Omp25和L7/L12對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響
　　 巨噬細(xì)胞負(fù)載Omp25后，從6h開(kāi)始，檢測(cè)到IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的分泌，到12hIL-6分泌達(dá)到最大值，到48h IL-1β、IL-8、IL-10的分泌達(dá)到最大值，與陰性對(duì)照相比差異顯著(P<0.01)；與LPS協(xié)同作用巨噬細(xì)胞后，分泌的細(xì)胞因子均提高，與LPS相比

7、，差異顯著(P<0.01)，與陰性對(duì)照相比，差異顯著(P<0.01)，多克隆抗體阻斷后，各細(xì)胞因子分泌量均下降，與未阻斷組相比，差異顯著(P<0.01)。
　　 巨噬細(xì)胞負(fù)載L7/L12后，從6h開(kāi)始，檢測(cè)到IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10的分泌，到12hIL-6分泌達(dá)到最大值，到48h IL-1β、IL-8、IL-10的分泌達(dá)到最大值，與陰性對(duì)照相比差異顯著(P<0.01)；與LPS協(xié)同作用巨噬細(xì)胞后，分泌的細(xì)胞因子

8、均提高，與LPS相比，差異顯著(P<0.01)，與陰性對(duì)照相比，差異顯著(P<0.01)，多克隆抗體阻斷后，各細(xì)胞因子分泌量均下降，與未阻斷組相比，差異顯著(P<0.01)。
　　 3)Omp25和L7/L12對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響
　　 巨噬細(xì)胞負(fù)載Omp25后，可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)少量的caspase-3，與LPS協(xié)同刺激后可產(chǎn)生較多的caspase-3；巨噬細(xì)胞負(fù)載Omp25未能有典型的凋亡小體產(chǎn)生，但Omp25與LPS

9、協(xié)同作用可產(chǎn)生典型的凋亡小體；對(duì)負(fù)載Omp25后的巨噬細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞負(fù)載Omp25后細(xì)胞有藍(lán)色熒光，并且強(qiáng)于對(duì)照組細(xì)胞。Omp25與LPS協(xié)同刺激后出現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光。
　　 Omp25作用巨噬細(xì)胞能促進(jìn)由LPS刺激引起的巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α的增加。Omp25能促進(jìn)由LPS激活引起的NF-κB核轉(zhuǎn)位。當(dāng)omp25與P38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑SB203580作用后NF-κB未被激活；當(dāng)多克隆抗體對(duì)omp25進(jìn)行阻斷后，

10、NF-κB未被激活。
　　 巨噬負(fù)載細(xì)胞L7/L12后，可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生微量的caspase-3，與LPS協(xié)同刺激后可產(chǎn)生少量的caspase-3，巨噬細(xì)胞負(fù)載L7/L12后未能有典型的凋亡小體產(chǎn)生，但L7/L12與LPS協(xié)同作用可產(chǎn)生典型的凋亡小體；對(duì)負(fù)載L7/L12后的巨噬細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞負(fù)載L7/L12后細(xì)胞有藍(lán)色熒光。L7/L12與LPS協(xié)同刺激后出現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光。
　　 L7/L12作用巨噬細(xì)胞能促進(jìn)由L

11、PS刺激引起的巨噬細(xì)胞分泌的TNF-α的增加。L7/L12能促進(jìn)由LPS激活引起的NF-κB核轉(zhuǎn)位，當(dāng)L7/L12與P38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑SB203580作用后NF-κB未被激活；當(dāng)多克隆抗體對(duì)L7/L12進(jìn)行阻斷后，NF-κB未被激活。
　　 本研究通過(guò)以上試驗(yàn)得出：
　　 1)Omp25與L7/L12可激活巨噬細(xì)胞，提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性，增強(qiáng)殺菌能力，促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)病原菌的清除：
　　 2)Omp2