ABL-N對L1210細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、1-O-乙?；蠡ㄐ不▋?nèi)酯(ABL)是歐亞旋覆花中含量較高的活性成分之一,為倍半萜內(nèi)酯類化合物,具有抗腫瘤活性,但其穩(wěn)定性和溶解性都不太好,本實(shí)驗所用的藥物是ABL的衍生物,簡稱ABL-N。
　　 目的:觀察ABL-N對小鼠白血病細(xì)胞L1210增殖和凋亡的影響,并初步探討其作用的機(jī)制。
　　 方法:
　　 (1)MTT法測定ABL-N對小鼠白血病細(xì)胞L1210增殖的影響:取細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內(nèi),培養(yǎng)24 h

2、后,給藥組加入不同濃度的ABL-N溶液,對照組加與最高濃度組等量的DMSO。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后用Fluo-star在檢測波長570 nm條件下測定光密度值(OD value),計算各濃度的ABL-N對L1210細(xì)胞的抑制率。(2)臺盼藍(lán)拒染法檢測ABL-N對L1210存活細(xì)胞數(shù)的影響。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,給藥組給予不同濃度的ABL-N溶液,對照組加與最高濃度組等量的DMSO。培養(yǎng)后的分別于第24 h、48 h、72

3、h取樣,臺盼藍(lán)染色,計數(shù)活細(xì)胞,用活細(xì)胞數(shù)對時間繪制生長曲線。(3)通過瑞氏.吉姆薩染色和Hochest33258染色觀察ABL-N作用48 h后L1210細(xì)胞的形態(tài)變化。收集ABL-N(20 mg/L)處理后的細(xì)胞,進(jìn)行染色,觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。(4)用流式細(xì)胞儀測定ABL-N作用后L1210細(xì)胞的凋亡率和周期分布。取對數(shù)生長期的細(xì)胞,給予ABL-N(10、20 mg/L)作用48 h后,PI染色,在流式細(xì)胞儀上測定各組細(xì)胞的凋亡率和

4、周期分布。(5)Western-blot法檢測ABL-N作用后L1210細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化。(6)免疫熒光法檢測ABL-N作用后L1210細(xì)胞。P53蛋白表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 (1)用不同濃度ABL-N(5、10、20 mg/L)分別處理L1210細(xì)胞24h后抑制率分別為14.6％、38.5％、47.4％。作用48 h時抑制率分別為28.8％、63.2％、74.8％。72 h后抑制率分別為3

5、5.7％、81.5％、91.6％。表明ABL-N可明顯抑制L1210細(xì)胞的增殖,并呈現(xiàn)出濃度和時間依賴性。(2)用不同濃度ABL-N(5、10、20 mg/L)作用于L1210后,從生長曲線可以看出明顯的濃度效應(yīng)關(guān)系,且高濃度組加藥1 d后及中濃度組加藥2 d后,活細(xì)胞數(shù)量減少,說明ABL-N對體外培養(yǎng)的小鼠白血病L1210細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用及殺滅作用。(3)本研究采用Giemsa染色及Hoechst33258熒光染色方法分別觀察了A

6、BL-N作用于L1210細(xì)胞48 h后的形態(tài)變化,2種染色方法均顯示給藥組細(xì)胞呈現(xiàn)核聚集和碎裂等凋亡特征性形態(tài)學(xué)變化。(4)不同濃度的ABL-N(10、20 mg/L)作用48 h后凋亡率分別為13.6％、29.9％。溶劑對照組的凋亡率為3.57％。可見ABL-N作用后凋亡率明顯的增加。(5)ABL-N(10、20 mg/L)作用48 h后G1期細(xì)胞數(shù)量由26.8％增加到30.9％、51.4％,S期細(xì)胞數(shù)量由73.2％下降到69.1％、

7、48.6％。(6)不同濃度的ABL-N(5、10、20 mg/L)作用48 h后,Bax/β-actin比例由0.49分別增加到0.58、0.71(P＜0.01)、0.82(P＜0.01)。Bcl-2/β-actin比例由0.66分別下降到0.61、0.57(P＜0.05)、0.28(P＜0.01)。Bcl-2/Bax比值由1.36分別下降到1.17、0.80(P＜0.01)、0.34(P＜0.01)。(7)對照組p53蛋白表達(dá)的熒光強(qiáng)

8、度為63.5。不同濃度的ABL-N(5、10、20mg/L)作用48 h后的熒光強(qiáng)度分別為83.3(P＜0.05)、188.0(P＜0.01)、242.5(P＜0.01),有了明顯的增強(qiáng)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)ABL-N能明顯抑制小鼠白血病細(xì)胞L1210的增殖。(2)ABL-N對L1210細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性。(3)ABL-N影響細(xì)胞周期動力學(xué),使細(xì)胞停滯在G1期。(4)ABL-N抑制L1210細(xì)胞增殖作用可能與影