激素和SB203580對LPS刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、1L-10的影響及分子機制.pdf

1、目的：長期以來糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids，GCs)作為重要抗炎藥物用于炎癥性肺病(inflammatory lung disease，ILD)的治療。ILD是由于炎癥、免疫等各種因素導(dǎo)致肺及支氣管內(nèi)大量巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，釋放大量炎癥介質(zhì)產(chǎn)生瀑布級聯(lián)，進(jìn)而引起肺內(nèi)炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡造成的肺臟疾病。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，可以通過刺激機體各種免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞炎性介質(zhì)

2、，進(jìn)而誘發(fā)ILD。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages，AMs)是LPS的主要效應(yīng)細(xì)胞，釋放內(nèi)源性炎癥因子產(chǎn)生瀑布級聯(lián)是導(dǎo)致炎癥發(fā)生、發(fā)展的根本原因。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子-3(Signal transducers and activators of transcription-3，STAT3)的激活在調(diào)控ILD起著關(guān)鍵的作用。抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAP

3、K)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能減少致炎癥細(xì)胞因子的釋放。本實驗以小鼠AM為研究對象，觀察激素與p38MAPK特異性抑制劑SB203580對LPS刺激的上述細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10的影響，分析兩者是否存在協(xié)同作用并進(jìn)一步探討STAT信號途徑在其中的作用，為臨床應(yīng)用激素及p38MAPK抑制劑治療ILD提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.ELISA檢測LPS刺激細(xì)胞上清液中的TNF-α濃度。培養(yǎng)MH-S細(xì)胞株，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106/

4、ml，于24孔板中培養(yǎng)過夜，隨機分組：①對照組：加入與各實驗組體積相同的無血清RPMI1640培養(yǎng)液；②LPS+Dex組：終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后LPS刺激2h、6h、12h；③Dex組：終濃度為1×10-6mol/L的DEX刺激2h、6h、12h；④Dex+SB203580+LPS組：終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后，終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20 min后LPS刺激2

5、h、6h、12h；⑤LPS+SB203580組：終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20 min后LPS刺激2h、6h、12h；⑥LPS組：終濃度為100ng/ml的LPS刺激2h、6h、12h。
　　各組細(xì)胞刺激成功后取上清液，ELISA測定細(xì)胞上清液中TNF-α的含量。
　　2.ELISA檢測LPS刺激細(xì)胞上清液中的IL-10濃度。方法及分組同TNF-α測定。
　　3.免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測MH-S細(xì)胞中p

6、-STAT3的表達(dá)。將MH-S細(xì)胞于24孔板中進(jìn)行爬片，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106/ml，培養(yǎng)過夜，隨機分組：①對照組：加入與各實驗組體積相同的無血清RPMI1640培養(yǎng)液；②LPS+Dex組：終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后，LPS刺激30min；③Dex組：終濃度為1×10-6mol/L的DEX刺激30min；④Dex+SB203580+LPS組：終濃度為1×10-6mol/L的DEX預(yù)孵育2h后，終濃度為10μmo

7、l/L的SB203580預(yù)孵育20 min后，LPS刺激30min；⑤LPS+SB203580組：終濃度為10μmol/L的SB203580預(yù)孵育20 min后，LPS刺激30min；⑥LPS組：終濃度為100ng/ml的LPS刺激30min。各組MH-S細(xì)胞刺激成功后，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組細(xì)胞中的p-STAT3表達(dá)變化。
　　4.Western blot方法檢測MH-S細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3的表達(dá)。實驗分組同免疫細(xì)

8、胞化學(xué)法，于6孔板中上述各組細(xì)胞刺激成功后收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞內(nèi)p-STAT3、STAT3表達(dá)。
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，各組比較用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，各組之間進(jìn)一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗進(jìn)行兩兩比較分析是否有顯著性差異，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞上清液中TNF-α含量的變化：LPS刺激MH-S細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中

9、TNF-α含量在2h已經(jīng)開始升高，6h達(dá)高峰，12h稍下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DEX預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SB203580預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DEX和SB203580共同預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α增

10、加，與DEX+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與SB+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　2.細(xì)胞上清液中IL-10含量的變化：LPS刺激MH-S細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中IL-10含量在2h已經(jīng)開始升高，6h達(dá)高峰，12h已經(jīng)開始下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DEX預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加，與LPS組在2h、6h、12

11、h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SB203580預(yù)處理后，抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加，與LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DEX和SB203580共同預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，進(jìn)一步抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10增加，與DEX+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與SB+LPS組在2h、6h、12h分別比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　3.免

12、疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明：對照組細(xì)胞僅見微弱黃染；LPS刺激30min后細(xì)胞黃染最強；用DEX預(yù)處理后，LPS刺激引起的細(xì)胞黃染減弱；用SB203580預(yù)處理后，LPS刺激引起的細(xì)胞黃染減弱；用DEX和SB203580預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，LPS刺激引起的細(xì)胞黃染進(jìn)一步減弱；用DEX預(yù)處理后，未給予LPS刺激細(xì)胞微弱黃染。各組與對照組比較p-STAT3表達(dá)均顯著增高(P<0.05)；與LPS組比較，DEX+LPS組、SB+LPS組、DEX+S

13、B+LPS組p-STAT3表達(dá)均顯著減少(P<0.05)；與DEX+LPS組、SB+LPS組比較，DEX+SB+LPS組p-STAT3表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)。
　　4.Western-blot檢測p-STAT3結(jié)果表明：對照組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3微量表達(dá)；LPS刺激30min后細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)最強；用DEX預(yù)處理后，LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)減弱；用SB203580預(yù)處理后，LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)p-

14、STAT3表達(dá)減弱；用DEX和SB203580預(yù)處理后發(fā)揮協(xié)同作用，LPS刺激引起的細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)進(jìn)一步減弱；用DEX預(yù)處理后，未給予LPS刺激細(xì)胞內(nèi)p-STAT3表達(dá)微弱。各組與對照組比較p-STAT3表達(dá)均顯著增高(P<0.05)；與LPS組比較，DEX+LPS組、SB+LPS組、DEX+SB+LPS組p-STAT3表達(dá)均顯著減少(P<0.05)；與DEX+LPS組、SB+LPS組比較，DEX+SB+LPS組p-STAT3

15、表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)。
　　5.Western-blot檢測STAT3結(jié)果表明：各實驗組細(xì)胞內(nèi)非磷酸化STAT3表達(dá)，統(tǒng)計學(xué)無顯著差異(P>0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.LPS可引起MH-S細(xì)胞上清液中的TNF-α和IL-10分泌增加，用DEX、SB203580分別干預(yù)后，可抑制TNF-α、IL-10分泌，DEX和SB203580協(xié)同抑制TNF-α、IL-10分泌。結(jié)果提示p38MAPK抑制劑SB2035