PRRSV ADE途徑感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α的表達調(diào)控.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）可引起母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道疾病。PRRSV在世界范圍內(nèi)流行，造成巨大的經(jīng)濟損失?？贵w依賴的感染增強作用（ADE）是PRRSV的一個重要免疫學(xué)特征，同時也是PRRS防控中遇到的最大難題之一。PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞專嗜性，主要通過受體介導(dǎo)的胞吞作用感染豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）。 TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有促炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用的單核因子。核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB），作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途

2、徑中的樞紐，能夠調(diào)節(jié)TNF-α等基因表達。NF-κB活化時，從胞漿易位到胞核，DNA結(jié)合活性提高，上調(diào)TNF-α等目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。IKKβ是I-κB激酶的主要活性單位，參與NF-κB的活化過程。本研究用PRRSVBJ-4株經(jīng)ADE途徑體外感染PAM，分析了TNF-α、NF-κB及IKKβ的表達變化，探索PRRSV感染對豬肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α的表達調(diào)控。 分離培養(yǎng)PAM，采用標(biāo)準(zhǔn)的ADE測定方法確定PRRSVBJ-4株產(chǎn)生ADE

3、的條件。用104TCID50的PRRSV與等體積的10倍稀釋后再以2的指數(shù)倍（2-1～2-8）稀釋的陽性血清的混合物接種PAM，48h后收獲病毒，用Marc-145細(xì)胞測定子代病毒活性。結(jié)果表明，1：320稀釋的抗PRRSV抗體能顯著增強PRRSVBJ-4株的繁殖（p<0.5）。 用RT-PCR技術(shù)從PAMcDNA中擴增了TNF-α、NF-κB、IKKβ及β-actin部分基因片段，回收純化PCR產(chǎn)物，連接PMDI9-T載體，轉(zhuǎn)

4、化宿主菌JM109，提取質(zhì)粒DNA，得到重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。對重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進行PCR和測序鑒定，表明成功克隆了目的片段。系列梯度稀釋重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，進行SYBRGreen-I熒光定量PCR，Ct值與標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)之間存在良好的線性關(guān)系，建立了TNF-α及NF-κB、IKKB的SYBRGreen-I熒光定量PCR檢測方法。 PRRSVBJ-4株分別經(jīng)ADE途徑和正常途徑感染豬肺泡巨噬細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。利用SYBRG