豬圓環(huán)病毒2型感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)胞功能的影響.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征等相關(guān)疾病的重要病原.豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)既是其重要靶細(xì)胞,又是重要的免疫細(xì)胞.該研究將PCV2 BF株經(jīng)口、鼻接種40日齡健康仔豬,在接種后第3、7、14、21、42天收集PAM.通過(guò)測(cè)定感染后PAM的凋亡與吞噬功能、表面分子與抗原遞呈功能相關(guān)分子及細(xì)胞因子的表達(dá)動(dòng)態(tài),從細(xì)胞、分子與基因水平系統(tǒng)分析了PCV2感染對(duì)豬肺泡巨噬細(xì)

2、胞功能的影響.用RT-PCR技術(shù)從PAM中擴(kuò)增和克隆了豬抗原遞呈功能相關(guān)分子SAL-DM、CD80、CD86,和豬細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-18及GM-CSF.經(jīng)測(cè)序鑒定后,利用反向PCR技術(shù)構(gòu)建了相應(yīng)的缺失cDNA競(jìng)爭(zhēng)分子.通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)PCR方法,建立了各分子的標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)曲線,并得到其直線回歸方程.用流式細(xì)胞術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PAM凋亡現(xiàn)象,EA花環(huán)試驗(yàn)測(cè)定Fc受體數(shù)目,吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定吞噬功能.結(jié)

3、果顯示在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)均沒(méi)有觀察到PAM凋亡,表明PCV2感染不會(huì)誘發(fā)PAM凋亡.PAM的Fc受體和吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)目在感染后7天內(nèi)下降,之后基本恢復(fù),表明PCV2感染豬的PAM吞噬和清除病原體的功能出現(xiàn)短暫下降.用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定PAM的MHC分子數(shù),用定量競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)檢測(cè)抗原遞呈功能相關(guān)分子SLA-DM、CD80和CD86基因的mRNA轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài).結(jié)果顯示SLA-DR分子陽(yáng)性PAM數(shù)在PCV2感染后第3天時(shí)增加,隨后明顯下降,21天以后恢

4、復(fù)正常;而SLA ClassI分子一直沒(méi)有明顯變化;SLA-DM、CD80與CD86的mRNA含量變化趨勢(shì)相似,均是在感染后第3天時(shí)降到最低,7天時(shí)快速上升,21天以后基本恢復(fù)正常.MHC分子SLA-DR、抗原遞呈途徑中的重要伴侶分子SLA-DM和重要共刺激分子CD80與CD86等表達(dá)下調(diào),表明PCV2感染豬的PAM抗原遞呈功能減弱.用定量競(jìng)爭(zhēng)PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、IL-10、IL-12p4

5、0、IL-18、GM-CSF等基因mRNA的表達(dá)動(dòng)態(tài).結(jié)果顯示IL-10 mRNA在接種后7天內(nèi)表達(dá)增加,14天以后恢復(fù)正常;IL-12p40、IL-18、GM-CSF和MCP-1 mRNA表達(dá)在接種后3天內(nèi)急劇減少,之后增加,14天或21天時(shí)到達(dá)峰值,之后下降至恢復(fù)正常;IL-8 mRNA在接種后7天內(nèi)明顯下降,14天時(shí)才急劇上升;TNF-αmRNA沒(méi)有明顯變化;而IL-1βmRNA在接種后14天內(nèi)均維持高水平表達(dá).細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)