cGAS-STING在豬圓環(huán)病毒2型感染中的作用研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus Type2，PCV2)是一種單鏈環(huán)狀DNA病毒，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)為主的豬圓環(huán)病毒病(porcine circovirusassociated disease，PCVAD)的關(guān)鍵病原分子(Karuppannan and Opriessnig2017)。被PCV2感染的豬，可發(fā)生免疫抑制，天然免疫應(yīng)答減弱，對多種病原易感，導(dǎo)致嚴(yán)重的多病原混合感染，病死率高，給養(yǎng)

2、豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通常，病毒感染機(jī)體后會被機(jī)體識別并引起相應(yīng)的免疫應(yīng)答，cGAS/STING作為一種關(guān)鍵的DNA感受通路，在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)以及一些炎性因子的分泌過程中發(fā)揮重要作用，但是cGAS、STING在PCV2感染機(jī)體引起機(jī)體免疫抑制的過程中怎樣發(fā)揮作用目前還沒有研究報道。
　　本試驗(yàn)以PK-15細(xì)胞作為基因編輯的模式細(xì)胞，運(yùn)用靶向于豬cGAS基因和sting基因的CRISPR-Cas9慢病毒敲除系統(tǒng)感染野生型PK

3、-15細(xì)胞，并用適當(dāng)濃度的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，得到陽性單克隆細(xì)胞，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，成功獲取了cGAS基因敲除細(xì)胞系和sting基因敲除細(xì)胞系，以相同滴度的PCV2分別感染野生型PK-15細(xì)胞、cGAS基因敲除細(xì)胞和sting基因敲除細(xì)胞，通過Real-time PCR和ELISA等方法檢測PCV2感染細(xì)胞后，細(xì)胞因子IFN-β、IL-6、IL-1β的變化以及病毒復(fù)制量的變化。
　　研究取得以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.利用CRISPR

4、-Cas9基因敲除系統(tǒng)成功得獲取了一株cGAS基因敲除細(xì)胞和一株sting基因敲除細(xì)胞。在靶向于cGAS基因376位點(diǎn)構(gòu)建的cGAS基因敲除細(xì)胞中，CDS區(qū)第277-284位堿基缺失，共缺失了7個堿基，導(dǎo)致后面序列發(fā)生移碼，cGAS蛋白第92位-第111位氨基酸都發(fā)生了突變，并在第111位氨基酸移碼終止;在靶向于sting基因196位點(diǎn)構(gòu)建的sting基因敲除的PK-15細(xì)胞中，sting基因的第194-198位堿基缺失，后面的序列發(fā)生

5、移碼突變，導(dǎo)致從65位氨基酸開始，氨基酸序列也出現(xiàn)多處突變。Western blotting結(jié)果顯示，靶向于cGAS基因376位點(diǎn)構(gòu)建的敲除細(xì)胞檢測不到cGAS蛋白的表達(dá)，靶向于sting基因196位點(diǎn)構(gòu)建的敲除細(xì)胞檢測不到STING蛋白的表達(dá)。
　　2.PCV2分別感染野生型PK-15細(xì)胞，cGAS敲除的PK-15細(xì)胞(376PK-15cGAs-/-)和sting敲除的PK-15細(xì)胞(196PK-15STING-/-)，Real

6、-time PCR結(jié)果顯示，與野生型PK-15細(xì)胞相比較，cGAS基因缺失會在PCV2感染的6h～24h均使IL-6、IL-1β表達(dá)量顯著升高;cGAS基因缺失，在PCV2感染的初期(6h、12 h)，對細(xì)胞內(nèi)IFN-βmRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，在感染PCV224 h時，使IFN-β的mRNA水平顯著升高;sting基因缺失會在PCV2感染的6h～24h均使IL-6、IFN-β mRNA水平顯著升高，而對IL-1βmRNA水平?jīng)]有顯

7、著影響。ELISA結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致。檢測cGAS、STING缺失對PCV2復(fù)制的影響發(fā)現(xiàn)，PCV2在cGAS基因敲除細(xì)胞和sting基因敲除細(xì)胞中的復(fù)制速度均顯著低于在其野生型PK-15細(xì)胞中的復(fù)制速度。
　　綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，本研究說明cGAS、STING均參與PCV2感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答過程，cGAS在PCV2感染PK-15細(xì)胞中可能參與調(diào)控炎癥小體的形成過程以及PCV2感染引起的炎癥反應(yīng)。而STING更