豬圓環(huán)病毒2型-豬瘟病毒共感染細(xì)胞的蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、隨著規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展、交通運(yùn)輸?shù)目旖莸纫蛩?，增加了豬群之間的接觸機(jī)會(huì)，也為病原體的流行和傳播創(chuàng)造了機(jī)會(huì)，造成發(fā)病豬群呈現(xiàn)兩種或多種病原的混合感染的現(xiàn)狀。越來越多的研究表明PCV2和CSFV在豬體內(nèi)能夠發(fā)生共感染，并且臨床的研究表明PCV2能干擾CSFV弱毒疫苗的保護(hù)效力，給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，PCV2-CSFV共感染時(shí)相互作用和對(duì)宿主的影響機(jī)制還未知。
　　在本研究中，為獲得效價(jià)較高的CSFV C株的多克

2、隆抗體，利用PEG6000濃縮法和蔗糖密度梯度離心純化法，制備純化的CSFV樣品。結(jié)果表明，經(jīng)濃縮純化的CSFV仍具有較高的感染活性，且毒價(jià)為病毒原液的1015倍以上。將純化的CSFV作為抗原接種新西蘭大白兔，獲得特異性和效價(jià)均較高的抗CSFV兔多抗血清。
　　為了有效地研究PCV2和CSFV共感染過程中病毒的交互影響以及細(xì)胞參與病毒復(fù)制的潛在機(jī)制，建立了一個(gè)的體外共感染模型。在該模型下PCV2不受CSFV復(fù)制影響，CSFV對(duì)PC

3、V2沒有免疫排斥現(xiàn)象;而CSFV的增殖卻以PCV2劑量依賴性的方式降低。PCV2和CSFV能定位于同一個(gè)細(xì)胞，且CSFV的E2從正常的細(xì)胞質(zhì)定位，易位到細(xì)胞核中。此外，相同劑量的PCV2感染PK15和PK15-CSFV，PCV2的感染率相同，并且介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡程度無顯著性差異;然而，PCV2劑量與細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)正相關(guān)，表明PCV2介導(dǎo)的凋亡可能與CSFV復(fù)制下調(diào)有關(guān)。另外，滅活PCV2及PCV2病毒成分孵育細(xì)胞不能介導(dǎo)細(xì)胞凋亡或影響CSF

4、V復(fù)制，表明PCV2復(fù)制介導(dǎo)的凋亡影響CSFV復(fù)制。這些結(jié)果足以解釋臨床上PCV2和CSFV共同感染導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀，以及CSFV弱毒疫苗免疫失敗問題。
　　為了探究在PCV2和CSFV共感染過程中涉及的宿主因子和分子機(jī)制，使用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定技術(shù)，分析陰性(NE)、PCV2單獨(dú)感染(SP)、CSFV單獨(dú)感染(SC)和PCV2-CSFV共感染(PC)的PK15樣品的整體蛋白質(zhì)組表達(dá)情況。在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)

5、中，共有3932個(gè)蛋白均檢測到。以表達(dá)比例≥1.2或≤0.83且p≤0.05作為上下調(diào)的閾值，與NE相比，SP中上、下調(diào)蛋白數(shù)分別為304個(gè)和198個(gè)，SC中分別為60個(gè)和61個(gè)，PC中分別為196個(gè)和156個(gè)。相對(duì)定量PCR、蛋白免疫印跡和共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)驗(yàn)證的結(jié)果表明，大部分基因/蛋白的表達(dá)趨勢與iTRAQ蛋白質(zhì)組結(jié)果一致。聚類、GO和KEGG分析證明在PCV2和CSFV共感染過程中PCV2具有主導(dǎo)作用。對(duì)PC/SC差異表達(dá)

6、蛋白進(jìn)行IPA分析，結(jié)果顯示蛋白14-3-3ζ、cullin3、ERK1/2、caspase和NF-κB可能在PCV2影響CSFV在體外完成生命周期的過程中具有重要作用。另外，進(jìn)一步對(duì)共感染條件下特異性差異表達(dá)的184個(gè)蛋白進(jìn)行KEGG和IPA分析，結(jié)果表明線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅳ和Ⅴ的多個(gè)蛋白均下調(diào)表達(dá)，由此推斷線粒體可能是PCV2和CSFV共感染時(shí)的主要靶標(biāo);除了線粒體功能失常外，共感染還特異性影響了氧化磷酸化、Nrf2介導(dǎo)的氧化應(yīng)

7、激、tRNA裝載、Myc介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞內(nèi)多種代謝通路的信號(hào)通路。這些數(shù)據(jù)為研究PCV2和CSFV共感染過程對(duì)細(xì)胞通路的影響及其分子機(jī)制提供參考。
　　綜上，本研究獲得了高效價(jià)高純度的CSFV C株病毒以及抗CSFV的兔多抗，為檢測CSFV提供工具;建立了PCV2和CSFV共感染模型，確定共感染過程中PCV2介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是削弱CSFV復(fù)制的原因;通過基于iTRAQ的蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué)分析，證明了PCV2和CSFV共感