高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬圓環(huán)病毒2型共感染協(xié)同致病性的研究.pdf

1、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,HP-PRRSV),是由PRRSV在NSP2基因(Nonstructural protein2)上缺失90個(gè)核苷酸形成的突變株。能夠引起不同生長階段豬高熱、高發(fā)病率和高死亡率,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine cirovirus type2,

2、PCV2)是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。近年來,國內(nèi)外有關(guān)PRRSV與PCV2共感染報(bào)告較多,引起廣泛關(guān)注。鑒于我國豬群中HP-PRRSV和PCV2共感染現(xiàn)象相當(dāng)嚴(yán)重,掌握兩種病毒的變異情況,深入了解這兩種病毒的協(xié)同致病作用十分重要。本研究對(duì)兩種病毒共感染進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查,對(duì)其流行毒株進(jìn)行了遺傳變異分析,并通過用兩種病毒不同時(shí)

3、間順序感染豬試驗(yàn)建立了共感染動(dòng)物模型,為我國HP-PRRSV和PCV2的綜合防制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 為掌握HP-PRRSV的變異情況,揭示該病的發(fā)生規(guī)律,本研究采用RT-PCR法對(duì)2005～2010年間送檢的282份病料進(jìn)行了PRRSV核酸檢測,對(duì)其中9份陽性樣品進(jìn)行了ORF5～7基因片段擴(kuò)增和測序,所得序列與GenBank下載的PRRSV CH-1a、VR2332、HB-2、LV株的ORF5序列進(jìn)行相似性比較,并與國內(nèi)已發(fā)表

4、的27株P(guān)RRSV ORF5序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化樹分析:此外,對(duì)GP5蛋白潛在糖基化位點(diǎn)與數(shù)目進(jìn)行了預(yù)測與分析。結(jié)果表明,9個(gè)流行毒株同屬于一個(gè)基因亞群,其ORF5序列相似性為95.0％～99.2％,氨基酸序列相似性為92.0％～99.0％；與4個(gè)參考毒株的ORF5序列相似性依次為93.4％～95.5％、87.6％～89.4％、91.2％～92.7％、63.0％～64.0％,氨基酸序列的相似性依次為91.0％～94.0％、85.6％～88

5、.6％、89.6％～92.0％、54.7％～58.2％;GP5糖基化位點(diǎn)分析:存在5個(gè)糖基化位點(diǎn)有3株,4個(gè)糖基化位點(diǎn)有5株,3個(gè)糖基化位點(diǎn)有1株；這些糖基化位點(diǎn)分布在第30～55位氨基酸之間,以第44、55位點(diǎn)保守,另3個(gè)位點(diǎn)存在變異。我國豬群中HP-PRRSV流行毒株變異幅度較大,GP5糖基化位點(diǎn)不同可能與毒力存在一定聯(lián)系。
　　 根據(jù)GenBank登錄的PRRSV和PCV2基因序列設(shè)計(jì)引物,采用RT-PCR和PCR法對(duì)20

6、05～2010年間送檢的282份病料進(jìn)行了HP-PRRSV和PCV2核酸檢測,旨在了解HP-PRRSV和PCV2的在豬群中的共同感染情況。結(jié)果表明,病料PRRSV核酸陽性檢出率為18.8％,PCV2核酸陽性檢出率為35.3％(101／282),PRRSV和PCV2共感染核酸陽性檢出率為10.7％,我國豬群中PRRSV和PCV2共感染現(xiàn)象較為普遍。
　　 為闡明HP-PRRSV和PCV2的協(xié)同致病作用,澄清兩種病毒不同時(shí)間順序共感

7、染與其協(xié)同致病力之間的關(guān)系。選取35日齡陰性健康豬30頭,隨機(jī)分6組,PCV2／HP—PRRSV順序共感染組、HP-PRRSV／PCV2順序共感染組、HP-PRRSV+PCV2同時(shí)共感染組、HP-PRRSV感染組、PCV2感染組、未接種對(duì)照組。感染后每天測量體溫、觀察臨床癥狀,每周稱量體重、采血。用流式細(xì)胞儀檢測血液中的CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、γδT、NK細(xì)胞及粒細(xì)胞和單核細(xì)胞變化；免疫過氧化物酶單層細(xì)胞試驗(yàn)

8、(IPMA)檢測這兩種病毒抗體變化；用ELISA法檢測血清中IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-2、GM-CSF細(xì)胞因子變化；用熒光定量PCR法檢測血清和組織中病毒載量。對(duì)各組試驗(yàn)豬進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。試驗(yàn)結(jié)果表明,HP-PRRSV／PCV2順序共感染組臨床癥狀最嚴(yán)重,死亡率達(dá)60％；組織和血清中病毒載量顯著高于其它組,抗體滴度明顯低于其它組；淋巴細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子(尤以TNF-α)變化也最為明顯。臨床豬群中HP-PRRSV和PC