高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子進化及抗原性漂變研究.pdf

1、豬繁殖和呼吸綜合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，又稱藍耳病(Blue-ear disease)，是出動脈炎病毒科的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種病毒性傳染病，是一種以導(dǎo)致母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙及仔豬高死亡率和育成豬呼吸困難、發(fā)育遲緩為特征的疫病。該病自發(fā)現(xiàn)以來已給世界各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。我國臺灣于1991年發(fā)現(xiàn)有該

2、病存在；1996年該病在北京及周邊地區(qū)大規(guī)模暴發(fā)，隨后該病不斷蔓延到全國各地；尤其是自2006年以來，PRRSV出現(xiàn)變異株，造成我國約3000萬頭豬只死亡。本研究以冀南地區(qū)分布的各規(guī)模豬飼養(yǎng)場為研究對象，連續(xù)三年采取抽樣和有針對性地進行PRRS的流行病學(xué)調(diào)查。然后進行病毒的滅活疫苗和病毒的分子進化及抗原性漂變研究。主要研究包括： 1.為預(yù)防和控制豬繁殖與呼吸綜合征，減少對養(yǎng)豬業(yè)帶來的巨大經(jīng)濟損失，自2006年以來對冀南地區(qū)16個

3、縣市開展了PRRS的流行病學(xué)調(diào)查，確定該地區(qū)此病的發(fā)病情況、流行規(guī)律及防治措施；在此基礎(chǔ)上，進行油乳劑滅活疫苗的制備與免疫效力研究。 2.根據(jù)GenBank中ATCC VR-2332(U87392)的全基因序列，設(shè)計了8對特異性引物，應(yīng)用一步法RT～PCR方法，通過反應(yīng)條件和反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化，直接從病料中擴增出HPPRRSV基因組中的Nsp2、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7蛋白基因的cDNA片段，其大小

4、分別為1200bp，1300bp，800bp，780bp，600bp，600bp，550bp和400bp。將上述8個基因片段重組到pUCm-T質(zhì)粒載體中，得到重組質(zhì)粒pUC-2.1，pUC-2.2，pUC-2，pUC-3，pUC-4，pUC-5，pUC-M，pUC-N。共獲得66個GenBank登錄號，序列同源性為94.3-100％。 3.用MEGA、PHYLIP等軟件進行分子進化研究，Nsp2及各結(jié)構(gòu)蛋白的進化樹結(jié)果均顯示HP

5、PRRSV與國內(nèi)原有分離株的親緣關(guān)系較近，尤其是與HB-1株的親緣關(guān)系最近；所有HPPRRSV均分離自國內(nèi)，推測HPPRRSV是由國內(nèi)野毒株發(fā)生突變進化而來；在各進化樹中HPPRRSV都可以分為三個大群，且江西分離株分布于HPPRRSV的各進化分枝上，從分子水平上證明HPPRRSV起源于江西。進化樹中HPPRRSV與各疫苗株的親緣關(guān)系均較遠，解釋了保護率低的原因。 4.通過DNAman等軟件推測氨基酸序列后比對，在前人已證明的3

6、6個抗原決定簇中HPPRRSV有30個發(fā)生了氨基酸突變，另有2個抗原決定簇缺失；用DNAstar軟件的Protean程序進行各氨基酸序列的抗原性預(yù)測分析，與標準株ATCC VR-2332(U87392)及各疫苗株相比，HPPRRSV發(fā)生了很大的抗原性漂變現(xiàn)象。 5.利用PAUP、PAML軟件及Datamonkey的網(wǎng)上分析，采用HKY85模型進行SLAC(0.1

7、ry=50)方法分析，在Gp5蛋白上分析得到一個陽性突變位點，分析認為HPPRRSV突變在向宿主轉(zhuǎn)移方向上積累。 6.利用BamH I，EcoR I位點將N蛋白基因片段克隆到pET-28a載體，構(gòu)建原核重組表達質(zhì)粒pET-N，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)獲得重組菌株BL21(DE3)(pET-N)；重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，N蛋白基因得到了高效表達；蛋白表達量可達菌體蛋白總量的52.635％，SDS-PAGE后切膠回收得到純化的N蛋白，