高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(HuN4--F112株)ORF1a誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生區(qū)域的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及各年齡階段豬呼吸系統(tǒng)疾病為主要癥狀的高度接觸性傳染病。PRRSV是有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科。目前關(guān)于PRRSV中和抗體產(chǎn)生的機(jī)制還不清楚。研究發(fā)現(xiàn)HP-PRRSV活疫苗HuN4-F112株和經(jīng)典PRRSV活疫苗CH-1R

2、株在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和二者之間的交叉保護(hù)等方面存在顯著差異。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究表明，HP-PRRSV HuN4-F112活疫苗ORF1a參與病毒的體外中和作用且ORF1a在誘導(dǎo)豬體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體的過程中起主要作用。ORF1a約占基因組大小的50％，編碼PRRSV的非結(jié)構(gòu)蛋白—NSP1-8，為了探究ORF1a哪些基因區(qū)域在中和抗體的產(chǎn)生過程中起作用，本研究做了如下探索:
　　在HuN4-F112感染性克隆的平臺(tái)上，將CH-1R

3、ORF1a的NSP1、NSP2、NSP2-8和NSP3-8基因區(qū)替換至HuN4-F112的相應(yīng)基因片段，構(gòu)建了4個(gè)嵌合質(zhì)粒并成功拯救出4株嵌合病毒即rHuN4-F112-TNSP1、rHuN4-F112-TNSP2、rHuN4-F112-TNSP2-8和rHuN4-F112-TNSP3-8。拯救病毒在Marc-145細(xì)胞上的生長曲線顯示:拯救病毒與親本病毒的復(fù)制速度基本一致。將嵌合病毒在Marc-145細(xì)胞上傳代測序發(fā)現(xiàn)嵌合病毒rHuN

4、4-F112-TNSP1發(fā)生了回復(fù)突變，另3株嵌合病毒在體外傳代過程中穩(wěn)定存在。將HuN4-F112免疫血清對(duì)嵌合病毒及rHuN4-F112做交叉中和試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):血清對(duì)嵌合病毒rHuN4-F112-TNSP2的交叉中和效價(jià)顯著低于對(duì)rHuN4-F112的中和效價(jià)，血清對(duì)另外3株嵌合病毒的交叉中和效價(jià)和對(duì)于rHuN4-F112相比差異不顯著。
　　將嵌合病毒rHuN4-F112-TNSP1、rHuN4-F112-TNSP2-8、rHu

5、N4-F112-TNSP3-8和親本病毒rHuN4-F112以106個(gè)TCID50分別注射PRRSV抗原抗體陰性的斷奶仔豬，每組3頭，并在攻毒后每周定時(shí)采血分離血清檢測病毒血癥，ELISA抗體以及對(duì)于嵌合病毒的中和效價(jià)。結(jié)果顯示:嵌合病毒rHuN4-F112-TNSP2-8免疫豬血清在研究期間一直未分離到病毒，rHuN4-F112-TNSP1免疫豬血清中分離出的病毒基因組序列分析顯示已經(jīng)全部發(fā)生回復(fù)突變，rHuN4-F112-TNSP3

6、-8免疫豬血清中分離出的病毒基因組測序表明序列沒有發(fā)生變化。中和試驗(yàn)結(jié)果顯示rHuN4-F112組能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的中和抗體而嵌合病毒rHuN4-F112-TNSP2-8組在研究期間抗體水平一直較低，rHuN4-F112-TNSP3-8在研究期間誘導(dǎo)中和抗體的滴度和rHuN4-F112相似。
　　綜上說明嵌合病毒rHuN4-F112-TNSP1在體內(nèi)、外傳代過程中不能穩(wěn)定存在，HuN4-F112活疫苗免疫豬血清對(duì)嵌合病毒rH