副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，H.parasuis）是定殖于豬上呼吸道的一種條件致病菌，在應(yīng)激或免疫抑制病原混合感染時，可引起以纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎和肺炎為特征的格拉瑟氏?。℅l(a)sser's disease），給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。豬肺泡巨噬細胞作為天然免疫細胞的重要組成部分，通過介導(dǎo)吞噬殺傷、產(chǎn)生活性氧及活性氮類來殺傷病原和釋放一些細胞因子和趨化因子聚集中性粒細胞等免疫細胞到感染部位發(fā)揮免疫功

2、能。
　　本課題從副豬嗜血桿菌感染宿主肺泡巨噬細胞的角度，使用RNA-seq技術(shù)，首次對強弱毒力副豬嗜血桿菌體外感染豬肺泡巨噬細胞傳代細胞系3D4/21的轉(zhuǎn)錄組進行分析。結(jié)果如下:
　　1.SH0165和HPS1712的抗吞噬能力和誘導(dǎo)細胞因子表達的比較
　　將副豬嗜血桿菌SH0165和HPS1712以10個MOI與豬肺泡巨噬細胞3D4/21互作8h，發(fā)現(xiàn)HPS1712的吞噬率顯著高于SH0165，說明SH0165抗吞

3、噬能力強于HPS1712。將SH0165和HPS1712與3D4/21細胞互作，然后檢測細胞因子mRNA的表達，發(fā)現(xiàn)在8h時SH0165感染組產(chǎn)生IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10表達水平高于HPS1712感染組。而在12h、24h時HPS1712感染組IL-1隊IL-6表達水平高于SH0165感染組。通過吞噬實驗和細胞因子的檢測，確定SH0165和HPS1712感染劑量為10個MOI。
　　2.副豬嗜血桿菌感染3D4/2

4、1細胞差異表達基因篩選和功能聚類分析
　　本研究采用SH0165，Nagasaki，SW114，HPS1712以10個MOI體外感染豬傳代肺泡巨噬細胞3D4/21，在感染后8h進行全轉(zhuǎn)錄組表達譜分析，結(jié)果顯示:SH0165，Nagasaki，SW114，HPS1712感染組中分別有542，502，662，37個差異表達基因，其中分別包括283，336，359，34個上調(diào)表達基因和259，166，303，3個下調(diào)表達基因，并對這些差

5、異表達基因進行了功能聚類分析。
　　3.差異表達基因的生物進程和信號通路富集分析
　　通過對四組差異表達基因進行注釋、生物進程和信號通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要與轉(zhuǎn)錄因子，基因表達，細胞分化，炎癥反應(yīng)，免疫反應(yīng)，細胞凋亡，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物進程有關(guān)，信號通路富集分析發(fā)現(xiàn):細胞因子與細胞因子受體相互作用、細胞凋亡、趨化因子信號通路、NF-kB、p53和MAPK信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體信號通路等通路聚集程度較

6、高。對這些差異表達基因功能和信號通路富集分析表明機體通過不同的免疫反應(yīng)策略來對抗H.parasuis感染。另外，強毒力菌株感染組的差異表達基因主要與細胞因子和趨化因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子、精氨酸酶活性等生物進程有關(guān)。弱毒力菌株感染組的差異表達基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬體形成等功能有關(guān)。
　　4.差異表達基因的驗證
　　為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的準確性，我們利用熒光定量PCR技術(shù)對不同信號通路中的基因，特別是細胞因子與

7、細胞因子受體互作通路中基因進行了驗證。其中包含22個上調(diào)差異表達基因，6個下調(diào)差異表達基因。熒光定量PCR驗證差異表達基因的結(jié)果與RNA-seq中差異表達基因的結(jié)果在趨勢上基本一致，說明RNA-seq結(jié)果是可靠的。
　　5.IL-19的功能驗證
　　通過對副豬嗜血桿菌感染3D4/21細胞后IL-19的mRNA和蛋白水平表達檢測、siRNA和過表達實驗和仔豬感染實驗發(fā)現(xiàn)并證實了IL-19與副豬嗜血桿菌病有關(guān)且抑制 IL-1α和