副豬嗜血桿菌SH0165體內(nèi)表達抗原的篩選及分析.pdf

1、副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是引起豬呼吸道疾病的主要病原之一。由其引起副豬嗜血桿菌病,又稱豬格拉瑟氏病(Gl(a)sser's disease)主要癥狀為多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎,同時還會引發(fā)腦膜炎。但目前對副豬嗜血桿菌毒力基因的研究大都是在體外模擬自然感染所處環(huán)境下開展的,關(guān)于其毒力或致病因子并沒有確切的報道。
　　 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)是一種不需要動物模型的高通量免疫篩選方法。通過利用已感染過目標

2、病原的宿主血清來研究在宿主體內(nèi)特異性表達的病原基因,能簡便有效的鑒定疾病感染過程中表達的病原微生物抗原基因。該技術(shù)具有可用于鑒定急性和慢性感染中在體內(nèi)特異表達免疫原性抗原,可同時捕獲外膜蛋白和分泌蛋白,可以檢測病原不同階段和不同路徑感染的情況等優(yōu)點。在很多病原,尤其是人類疾病的病原中有重要應(yīng)用,篩選到了很多有意義的致病相關(guān)因子,為開發(fā)新型藥物靶標,研制高效疫苗,建立診斷方法,提供了理論基礎(chǔ)。
　　 本課題針對副豬嗜血桿菌在宿主體

3、內(nèi)外差異表達的基因進行研究,應(yīng)用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)對副豬嗜血桿菌地方分離株SH0165進行體內(nèi)表達基因的篩選和鑒定。成功構(gòu)建了該菌株的基因組表達文庫,制備了豬的康復(fù)血清,運用免疫學(xué)技術(shù)篩選到24個體內(nèi)特異表達基因,并對其進行了驗證。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.HPS基因組表達文庫的構(gòu)建:選取已經(jīng)測序的SH0165菌株,提取基因組DNA,用Sau3AI酶切后回收0.5～3kb的片段,分別克隆到原核表達載體pQE80L/81L/82

4、L中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,構(gòu)建了基因組表達文庫。文庫重組覆蓋率大于80％,經(jīng)酶切和PCR鑒定,插入片段大小正確。文庫達到質(zhì)量要求,可以進行篩選研究。
　　 2.血清抗體探針的制備:將SH0165菌株攻毒豬只,收集康復(fù)血清,用副豬嗜血桿菌和大腸桿菌的菌體抗原、破碎上清以及分泌抗原以硝酸纖維素膜為載體對其進行吸附。ELISA檢測血清吸附效果,康復(fù)血清效價明顯降低,可用于文庫篩選。
　　 3.體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的篩選:用免疫印跡方法篩選經(jīng)

5、過IPTG誘導(dǎo)表達的文庫,經(jīng)過兩次篩選后得到39個陽性克隆。通過測序分析,確定開放閱讀框(ORF),共包括80個ORF。選取其中包含多個ORF的陽性克隆進行亞克隆,并再次使用免疫印跡方法對每個ORF進行篩選,最終得到24個體內(nèi)表達基因。
　　 4.體內(nèi)表達基因的驗證:制備副豬嗜血桿菌SH0165的免疫血清。分別用經(jīng)過大腸桿菌抗原吸附的免疫血清和康復(fù)血清作為一抗免疫鑒定24個體內(nèi)表達基因,發(fā)現(xiàn)75％的基因與免疫血清不反應(yīng)而與康復(fù)血

6、清反應(yīng),證明這些基因是在宿主體內(nèi)特異表達的。并選取其中編碼宿主核酸酶抑制蛋白的基因gam和編碼細胞桿狀決定蛋白的基因mreC進行原核表達和蛋白純化,通過Western blot從表達水平上驗證了這兩個基因的體內(nèi)表達特性。
　　 使用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)篩選到的副豬嗜血桿菌的基因主要屬于代謝,調(diào)控,粘附,轉(zhuǎn)運,細胞結(jié)構(gòu)以及抗藥性幾個方面。有些基因可能是副豬嗜血桿菌的潛在毒力因子,有的基因可能具有較好的免疫原性,可作為疫苗的候選基因,但