副豬嗜血桿菌的分離與鑒定

1、1副豬嗜血桿菌副豬嗜血桿菌的分離與鑒定的分離與鑒定李曉華楊小燕鄭新添戴愛玲李改娜（福建龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點實驗室福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術(shù)研究中心福建龍巖364000）摘要：摘要：從福建省龍巖市l(wèi)例臨床癥狀、病理剖檢變化疑似副豬嗜血桿菌病的患病豬的關(guān)節(jié)液中分離到1株革蘭氏染色陰性可疑菌株，經(jīng)衛(wèi)星現(xiàn)象、生化鑒定等實驗室診斷，進一步以副豬嗜血桿菌的16SrRNA基因設(shè)計特異性引物進行PCR鑒

2、定，確定該分離菌為副豬嗜血桿菌。藥敏試驗結(jié)果表明，分離株對環(huán)丙沙星、氨芐西林、阿米卡星、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺類等藥物敏感；對阿莫西林、諾氟沙星有抵抗力。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：副嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗IsolationIdentificationofHaemophilusparasuisXiaohuaLixiaoyanYangxintianZhengailingDaigainaLi1.CollegeofLifeSciencesLong

3、yanUniversityLongyanFujianProvince364000PRChina2.KeyLabatyofPreventiveVeterinaryMedicineBiotechnologyLongyanUniversityLongyanFujianProvince364000PRChina3.EngineeringResearchCenterfthePreventionControlofZoonosis，F(xiàn)ujianPro

4、vince364000PRChinaAbstract：AcoveyofswinewhoseclinicalsymptomslookedlikeHaemophilusparasuisdiseasewerecheckedbylabtechnologiesResearchasbacteriaobservation，culturalacteristicsbiochemicalpropertiesofHaemophilusparasuiswere

5、doneAccdingtothesequenceofbacteriuml6SrRNA，specialprimersweredesignedfPCRamplification.TheresultsshowedthatthestrainwastentativelyidentifiedasHaemophilusparasuisThedrugsensitivetestsshowed：thestrainwassensitiveto環(huán)丙沙星、氨芐西

6、林、阿米卡星、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺類等藥物敏感；對阿莫西林、諾氟沙星Keywds：Haemophilusparasuis；isolationidentificationdrugsensitivetest——————李曉華(1968、8—)女福建長汀人，高級實驗師，主要從事實驗室管理及動物疫病防控研究。3豬副嗜血桿菌病(Haemophilusparasuis，Hps)又稱“革拉瑟氏病”(Gllisser’sDisease)，是由副豬嗜

7、血桿菌(Haemophilusparasuis)引起的一種以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的疾病[1]。該菌寄生在健康豬鼻腔等上呼吸道內(nèi)，主要通過空氣直接接觸傳播，其他傳播途徑如消化道等亦可傳播[2]。主要影響2～4周齡的豬，感染高峰為4～6周齡的豬[3]，發(fā)病率在10%～15%，嚴重時病死率可達50%。隨著規(guī)?；B(yǎng)殖和養(yǎng)殖密度的增加，近年來，該病的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢，成為危害規(guī)?；B(yǎng)豬場最嚴重的細菌性疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)

8、濟損失。2008年10月，福建龍巖某規(guī)?；i場5—8周齡的保育豬發(fā)病嚴重臨床癥狀主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減少，體溫升高4041℃流鼻涕腹式呼吸被毛粗亂，消瘦、關(guān)節(jié)腫大，病豬不愿站立，跛行，病程達4個多月，發(fā)病率40%。剖檢病變主要表現(xiàn)為體內(nèi)有水腫、充血、血液不凝呈暗紅色全身臟器多數(shù)有出血斑點膀胱粘膜和腎皮質(zhì)點狀出血喉、會咽斑狀出血胸腔內(nèi)有大量淡紅色液體、纖維性滲出物心包有大量纖維素性滲出物，似菜花狀；肺臟呈纖維素性胸膜肺炎腹腔內(nèi)有大量透

9、明黃褐色滲出液；關(guān)節(jié)腔內(nèi)充滿黃色渾濁液。懷疑豬副嗜血桿菌感染而致，隨機采集病料進行病原分離鑒定及藥敏試驗。1材料與方法材料與方法1.1材料1.1.1病料采自福建省龍巖市某豬場疑似Hps發(fā)病仔豬的肺臟、心血、關(guān)節(jié)積液、心包液、氣管。1.1.2培養(yǎng)基普通瓊脂培養(yǎng)基、鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基由實驗室配制、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基購于青島海博公司；0.005%NAD巧克力瓊脂培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購于北京陸橋技術(shù)有限責

10、任公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購于成都貝斯特試劑有限公司1.1.3生化微量鑒定管H2S、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、D核糖、葡萄糖酸、檸檬酸鹽均購自杭州天和微生物試劑有限公司。1.1.4藥敏試紙：強力霉素、阿莫西林、磺胺6甲氧嘧啶、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、阿米卡星、恩諾沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考、復(fù)方治菌磺、林可大觀、磺胺間甲氧嘧啶、泰妙菌素、泰

11、樂菌素等藥敏紙片由實驗室自制。1.1.5PCR反應(yīng)試劑：如TaqDNA聚合酶(5IUμL)、蛋白酶K、dNTPs，均由寶生物(大連)有限公司提供，20℃保存。1.1.6引物設(shè)計與合成參照SimoneOliveira等[9]的報道合成引物：上游引物P1：5′GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3′下游引物P2：5′GGCTTCGTCACCCTCTGT3′，預(yù)擴增片段大小為821bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2

12、1細菌的分離培養(yǎng)無菌取送檢的疑似患病豬的肺臟、心血、心包液、氣管和關(guān)節(jié)積液，劃線接種于巧克力培養(yǎng)基和5%新生牛血清TSA培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，燭缸培養(yǎng)2448h，觀察結(jié)果。1.2.2細菌形態(tài)及生化特性檢查1.2.2.1細菌形態(tài)學(xué)檢查挑取TSA平板上生長的疑似菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察細菌的形態(tài)特征。12.2.2細菌培養(yǎng)特性挑取TSA平板上生長的單菌落，分別接種于含0.005%NAD的兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基平板、5%新生牛血清TSA