副豬嗜血桿菌LAMP快速檢測方法的建立.pdf

1、副豬嗜血桿菌（Haemophlius parasuis，Hps）危害嚴(yán)重，是目前養(yǎng)豬業(yè)的多發(fā)病之一，建立快速準(zhǔn)確的診斷方法，及時采取相應(yīng)的防治措施是防治成功的關(guān)鍵。但是副豬嗜血桿菌分離難度較大，常規(guī)的檢測方法比較繁瑣，且需要昂貴的儀器設(shè)備，很難在基層推廣。而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）簡單方便，不需要特殊設(shè)備，所以建立基于LAMP的副豬嗜血桿菌的快速檢測方

2、法十分必要，在臨床檢測中的應(yīng)用潛力非常大。
　　本研究通過比對GengBank中已發(fā)表的Hps16S rRNA序列，找出其高度保守區(qū)域，以此為靶基因并針對其6個特異性區(qū)域設(shè)計(jì)出4條特異性引物：兩條外引物 F3、B3和兩條內(nèi)引物 FIP、BIP，利用 Bst DNA聚合酶的鏈置換作用對Hps進(jìn)行 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件建立了 Hps的LAMP快速檢測方法，并檢測該方法的靈敏性與特異性。
　　1.最佳反應(yīng)體

3、系的篩選
　　通過設(shè)置單因素梯度變化分別對反應(yīng)體系中的內(nèi)外引物比（ F3∶FIP， B3∶BIP）、Mg2+終濃度、dNTPs終濃度進(jìn)行優(yōu)化，內(nèi)引物比梯度為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10，Mg2+終濃度梯度為0 mM、2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM，dNTPs終濃度梯度為0 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM。最終確立了LAMP反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系：外引物各0.2μM，內(nèi)引物

4、各0.8μM，Mg2+終濃度為6 mM，dNTPs終濃度為3 mM，10×ThermoPol緩沖液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，模板1μL，補(bǔ)水至25μL。
　　2.最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化
　　通過設(shè)置單因素梯度變化分別對反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)溫度梯度為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃，反時間梯度為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。結(jié)果顯示反應(yīng)在63℃

5、條件下1 h即可完成。
　　3. LAMP靈敏性檢測
　　對Hps基因組DNA進(jìn)行10-n倍梯度稀釋，以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8倍稀釋的基因組為模板分別進(jìn)行常規(guī) PCR反應(yīng)和 LAMP反應(yīng)，通過比較兩種反應(yīng)的檢測結(jié)果來反映 LAMP反應(yīng)的敏感性。結(jié)果顯示LAMP方法敏感性是PCR的100倍，最低檢出量為0.241 pg/μL。
　　4. LAMP特異性檢測<

6、br>　　分別以副豬嗜血桿菌、豬鏈球菌（ Streptococcus suis）、沙門氏菌（ Salmonella enteriditis）、大腸桿菌（ Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylocococcus aureus）為模板，用本研究所建立的方法進(jìn)行LAMP反應(yīng)，驗(yàn)證