豬胞內勞森氏菌LAMP、PCR快速檢測方法的建立及應用.pdf

1、豬增生性腸炎(Porcine proliferative enteropathy, PPE)是由于豬感染胞內勞森氏菌引起的一種傳染性腸道出血性的消耗性疾病，1931年Bieste和Sohwarce首次報道了該病，1974年Rowland等證實了該病，該病現(xiàn)已成為世界上流行最廣的豬病之一。雖然，豬增生性腸炎引起的死亡率不高，但由于其主要發(fā)病為慢性型，使得患病豬生長緩慢，飼料利用率和平均日增重明顯下降，淘汰率上升，導致豬場經濟損失嚴重。一些

2、養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)，由于飼料中抗生素的禁用或限用，導致豬增生性腸炎發(fā)病率逐年上升。在我國，臨床豬增生性腸炎疑似病例有逐漸增多的趨勢，但我國對豬增生性腸炎的研究還處于起步階段，缺乏對該病的流行病學調查，因此開發(fā)快速準確的臨床檢測方法對于該病的研究具有重要的意義。
　　本試驗根據(jù)引物設計原理，針對胞內勞森氏菌AM18025.2.1基因序列分別設計了PCR和環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amp

3、lification，LAMP)特異性引物，通過對PCR方法退火溫度的優(yōu)化，LAMP方法的反應溫度、反應時間、內外引物比例、dNTP濃度、鎂離子濃度、甜菜堿的優(yōu)化，確定其最優(yōu)反應條件后成功建立了胞內勞森氏菌的PCR和LAMP兩種檢測方法。靈敏度實驗結果表明建立的PCR方法可檢出的拷貝數(shù)為103個，LAMP方法可檢出的拷貝數(shù)為101個;特異性試驗表明，PCR方法和LAMP方法對E.coli、Salmonella、PEDV、PRV擴增結果均

4、為陰性，且這兩種方法穩(wěn)定性和重復性良好。LAMP反應產物還可進行可視化檢測，陽性反應產物在自然光下出現(xiàn)明顯渾濁，加入SYBR GreenⅠ染料后，在紫外燈照下，陽性反應管發(fā)出綠色熒光，而陰性反應管無熒光現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　應用本試驗建立的PCR和LAMP兩種方法檢測從四川部分規(guī)?；B(yǎng)豬場采集的114份糞便樣本，其中60份樣本(52.6％)利用PCR和LAMP檢測方法均檢出為陽性，13份樣本(11.4％)利用LAMP檢測方法檢出為陽性，

5、PCR檢測方法檢出為陰性，41份樣本(36.0％)利用PCR和LAMP檢測方法均檢出為陰性。應用FIRSTtest試劑盒進行復核檢測，PCR檢測方法的符合率為76.0％，LAMP檢測方法的符合率為92.4％，LAMP檢測方法具有更高的靈敏度。
　　胞內勞森氏菌引起的豬增生性腸炎造成的死亡率不高，但是對豬場的經濟造成較大的損失，且該病目前在我國感染率較高。本試驗所建立的PCR和LAMP兩種方法具有快速簡便的特點，且LAMP方法不需要