COPD患者血清和SB203580對(duì)LPS刺激小鼠肺泡巨噬細(xì)胞分泌RANTES、Il-10的影響.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種慢性氣道炎癥性疾病，以氣流受限、反復(fù)咳嗽、咳痰、氣促和呼吸困難為主要特征，且其氣流受限不完全可逆并呈進(jìn)行性發(fā)展，其發(fā)病過(guò)程中活化的炎癥細(xì)胞釋放多種介質(zhì)，是由于感染、免疫、中毒等因素引起肺部和各級(jí)支氣管內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，包括巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等，這些炎性細(xì)胞均能夠釋放炎癥介質(zhì)導(dǎo)致瀑布級(jí)聯(lián)，從而促使肺部炎性介質(zhì)和抗炎介質(zhì)失衡

2、引發(fā)肺部疾病。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠刺激機(jī)體中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放大量炎性介質(zhì)，從而促進(jìn)COPD等炎癥性肺病（inflammatory lung disease，ILD）的發(fā)生。肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophages，AMs）是LPS引起COPD等ILD發(fā)生主要效應(yīng)細(xì)胞，是肺第一道防線，它能夠釋放多種炎癥因子從而使炎性介質(zhì)、抗炎介質(zhì)失衡誘發(fā)肺部炎癥。抑制絲裂原活化蛋白激酶(mito

3、gen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以減少促炎因子的釋放。參與其中的這些細(xì)胞因子可能成為COPD治療的新靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中我們以小鼠肺泡巨噬細(xì)胞株(MH-S)為研究對(duì)象，觀察COPD患者血清與p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)LPS誘導(dǎo)上述細(xì)胞分泌RANTES和IL-10的影響，并進(jìn)一步探討RANTES的表達(dá)，為將p38MAPK抑制劑應(yīng)用于臨床治療COPD提供了新的理論基礎(chǔ)。
　　

4、 方法:1、用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中RANTES濃度。常規(guī)培養(yǎng)MH-S細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/ml，將細(xì)胞置于24孔板中培養(yǎng)并過(guò)夜，隨機(jī)分組:①對(duì)照組:分別以1％、5％、10％健康人及COPD患者血清+RPMI1640及10％小牛血清+RPMI1640作為培養(yǎng)液孵育MH-S細(xì)胞;②LPS組:分別以1％、5％、10％健康人及COPD患者血清+RPMI1640及10％小牛血清+RPMI1640作為培養(yǎng)液孵育MH-S細(xì)胞6h后

5、，應(yīng)用LPS刺激，調(diào)整終濃度為100ng/ml;③LPS+SB組:分別以1％、5％、10％健康人及COPD患者血清+RPMI1640及10％小牛血清+RPMI1640作為培養(yǎng)液孵育MH-S細(xì)胞6h后，加入SB203580和LPS進(jìn)行刺激，調(diào)整SB203580和LPS的終濃度分別為10μmol/L和100ng/ml，并使SB203580提前孵育20min后再加入LPS刺激。各組分別刺激6h，收集細(xì)胞上清液，凍存于-80℃冰箱，待ELISA

6、法檢測(cè)RANTES濃度。
　　 2、用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的IL-10濃度，方法和分組與RANTES測(cè)定相同。
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定RANTES的表達(dá)變化。調(diào)整細(xì)胞濃度1×106/ml，于24孔板爬片過(guò)夜，仍按以上分組對(duì)MH-S細(xì)胞刺激后，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中RANTES的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:1、細(xì)胞上清液中的RANTES含量變化:①LPS刺激MH-S細(xì)胞，細(xì)胞上清液中RANTES含

7、量增加，且隨血清濃度增高而增加，且用COPD患者血清孵育的細(xì)胞上清液中RANTES含量高于健康人。與相同類(lèi)型血清同一濃度對(duì)照組相比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用p38MAPK抑制劑SB203580+LPS干預(yù)后，RANTES含量減少，但仍高于對(duì)照組，與相同類(lèi)型血清同一濃度對(duì)照組相比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相同類(lèi)型血清同一濃度LPS組與LPS+SB203580組比較(P＜0.05)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②隨著COPD

8、患者血清濃度增高，RANTES含量在control組、LPS組和LPS+SB組均呈高度正相關(guān)(r=0.966,P＜0.01;r=0.974，P＜0.01;r=0.945，P＜0.01);隨著健康人血清濃度增高，RANTES含量在control組、LPS組和LPS+SB組亦呈高度正相關(guān)(r=0.968，P＜0.01;r=0.979，P＜0.01;r=0.965，P＜0.01)。③COPD患者血清和LPS共同作用MH-S細(xì)胞可發(fā)揮協(xié)同作用，

9、進(jìn)一步誘導(dǎo)RANTES增加，與同一血清濃度健康對(duì)照組相比較(P＜0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、細(xì)胞上清液中的IL-10含量變化:①LPS刺激MH-S細(xì)胞，細(xì)胞上清液中IL-10含量增加，且隨血清濃度增高而增加，但用COPD患者血清孵育的細(xì)胞上清液中IL-10含量低于健康人。與相同類(lèi)型血清同一濃度對(duì)照組相比較（P＜0.05）其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用p38MAPK抑制劑SB203580+LPS干預(yù)后，IL-10含量減少，但

10、仍高于對(duì)照組。與相同類(lèi)型血清同一濃度對(duì)照組相比較其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。相同類(lèi)型血清同一濃度LPS組與LPS+SB203580組比較（P＜0.05）也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②隨著COPD患者血清濃度增高，IL-10含量在control組、LPS組和LPS+SB組均呈顯著正相關(guān)(r=0.920，P＜0.01;r=0.923，P＜0.01;r=0.765，P＜0.01);隨著健康人血清濃度增高，IL-10含量在control組、LPS組

11、和LPS+SB組亦呈高度正相關(guān)(r=0.983,P＜0.01;r=0.878，P＜0.01;r=0.985，P＜0.01)。③COPD患者血清與LPS對(duì)誘導(dǎo)IL-10分泌協(xié)同作用不明顯。
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定RANTES的表達(dá):對(duì)照組細(xì)胞質(zhì)僅有微弱黃染;LPS刺激細(xì)胞后胞漿黃染增強(qiáng);用SB203580預(yù)處理后，LPS刺激引起的胞漿黃染減弱但仍強(qiáng)于對(duì)照組;隨著血清濃度增高胞漿黃染增強(qiáng)且COPD患者較健康人及小牛血清者黃染顯著

12、，各組與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LPS組與LPS+SB203580組比較（P＜0.05）也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:1、LPS可引起MH-S細(xì)胞上清液中的RANTES及IL-10分泌增加，用SB203580干預(yù)后，RANTES、IL-10分泌減少，但仍高于對(duì)照組，提示SB203580可能部分抑制RANTES及IL-10分泌。
　　 2、同一COPD患者隨著血清濃度的增加RANTES及IL-10含量均呈