TAK1抑制TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 本課題旨在探討TAK1介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡中的作用以及相關(guān)的分子機(jī)制。研究內(nèi)容包括三個(gè)部分:一、觀察TGF-β1在巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡中的作用和對TLR4受體表達(dá)的影響;二、觀察TAK1在TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡中的作用;三、探討TAK1介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的相關(guān)分子機(jī)制。
　　 研究方法與結(jié)果:
　　 本課題實(shí)

2、驗(yàn)分三部分進(jìn)行:
　　 第一部分應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測TGF-β1刺激對巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的影響，包括以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn):
　　 1、分別用5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞12小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡情況，結(jié)果顯示TGF-β1具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的作用，且這種作用具有劑量依賴性;
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)檢測TGF-β1刺激對巨噬細(xì)胞RAW264.7 TL

3、R4表達(dá)的影響，這部分實(shí)驗(yàn)分組如下:對照組，100ng/ml LPS組、10ng/ml TGF-β1組、LPS與TGF-β1聯(lián)合刺激組、1μg/ml anti-TGF-β1中和抗體組，以及LPS與anti-TGF-β1中和抗體聯(lián)合刺激組，檢測結(jié)果顯示，單獨(dú)LPS、TGF-β1均能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)下降，并且二者聯(lián)合刺激時(shí)效應(yīng)增強(qiáng)，LPS與anti-TGF-β1聯(lián)合刺激和LPS單獨(dú)刺激時(shí)相比，TLR4表達(dá)無明顯變化，說明LPS與外源

4、性TGF-β1具有協(xié)同抑制TLR4表達(dá)的作用。
　　 第二部分利用電轉(zhuǎn)染的方法在巨噬細(xì)胞RAW264.7中過表達(dá)TAK1，流式細(xì)胞術(shù)檢測TAK1對TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的影響，包括以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn):
　　 1、分別電轉(zhuǎn)染10μg、15μg空質(zhì)粒CMV、野生型質(zhì)粒TAK1以及TAK1突變體TAK1K63W，60h后用10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞30min，流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡情況，結(jié)果顯

5、示:與空質(zhì)粒CMV、TAK1突變體TAK1K63W相比，TAK1具有明顯抑制TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的作用，以10μg TAK1抑制凋亡效應(yīng)最明顯。
　　 2、檢測TAK1在TAB1作用下對TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)分組如下:Empty plasmid組、TAB1組、TAK1組、TAK1與TAB1共轉(zhuǎn)染組、TAK1K63W組、TAK1K63W與TAB1共轉(zhuǎn)染組，結(jié)果顯示TAK1具有抑制TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)

6、胞細(xì)胞凋亡的作用，并且在與TAB1共轉(zhuǎn)染時(shí)，TAK1抗凋亡效應(yīng)進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　 第三部分探討TAK1抑制TGF-β1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，包括以下兩個(gè)實(shí)驗(yàn):
　　 1.TAK1對TGF-β1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-10等細(xì)胞因子的影響，實(shí)驗(yàn)分組如前，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒入巨噬細(xì)胞，60h后，10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞24小時(shí)，ELISA檢測炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10，結(jié)果顯示:與對照組相

7、比，TAK1、TAK1與TAB1共轉(zhuǎn)染組在TGF-β1刺激后TNF-α分泌減少，各轉(zhuǎn)染組IL-10分泌與對照組相比無明顯差異。
　　 2.檢測TAK1對TGF-β1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的影響:實(shí)驗(yàn)分組如前，轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒入巨噬細(xì)胞，60h后，10ng/ml TGF-β1刺激巨噬細(xì)胞，提取蛋白，Western blot檢測巨噬細(xì)胞中caspase-3活化情況，結(jié)果顯示，對照組在TGF-β1刺激時(shí)，caspase-3明顯活化，過

8、表達(dá)TAK1后caspase-3活化受抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1、TGF-β1具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7凋亡的作用，且這種作用呈劑量依賴性;TGF-β1具有抑制巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)的作用。
　　 2、在巨噬細(xì)胞RAW264.7中過表達(dá)TAK1能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡效應(yīng)，TAB1具有促進(jìn)TAK1抗凋亡效應(yīng)的作用。
　　 3、TAK1抑制TGF-β1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的凋亡與TGF-β1刺