TGF-β1誘導(dǎo)下人肝星狀細(xì)胞糖蛋白糖譜的研究.pdf

1、目的：許多疾病的發(fā)生伴隨著相關(guān)糖蛋白糖基化的改變，糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的多樣性對其生理功能起著重要的作用。目前已證明多種癌癥均有細(xì)胞內(nèi)糖譜變化。肝纖維化作為一種普遍多發(fā)的疾病，如不能及時診斷和治療可發(fā)展為肝硬化。肝星狀細(xì)胞(HepaticStellate Cells，HSCs)是肝臟合成細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrixc，ECM)的主要細(xì)胞。HSCs的活化與增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。目前針對HSCs的研究多在基因?qū)用妫?/p>

2、糖譜的研究很少涉及。因此本實(shí)驗(yàn)利用凝集素芯片對HSCs糖蛋白糖鏈進(jìn)行規(guī)?；治鲅芯?，比較“靜態(tài)”HSCs和經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factorβ1，TGF-β1)誘導(dǎo)活化的HSCs的糖蛋白糖鏈表達(dá)差異，尋找肝纖維化相關(guān)糖蛋白糖鏈，分析糖基化蛋白與肝纖維化的關(guān)系，研究肝纖維化過程中蛋白糖基化修飾的改變，推測肝纖維化相關(guān)糖蛋白糖鏈的合成通路。
　　 方法：以LX-2細(xì)胞系為肝星狀細(xì)胞系模型，采取終

3、濃度為2ng/mL的TGF-β1誘導(dǎo)刺激LX-2細(xì)胞24h。半定量RT-PCR檢測LX-2細(xì)胞系是否發(fā)生肝纖維化變化。提取對照組LX-2細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)組LX-2細(xì)胞總蛋白，Cy3熒光標(biāo)記，與凝集素芯片孵育，觀察表達(dá)差異糖蛋白，分析糖蛋白糖鏈修飾變化，利用已公開相關(guān)基因芯片研究結(jié)果推測肝纖維化過程中糖鏈合成通路及其與糖基化修飾變化的關(guān)系。
　　 結(jié)論：通過半定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和MMP-2基因在經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF

4、-β1)誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中高表達(dá)。證明TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞系發(fā)生肝纖維化的細(xì)胞培養(yǎng)方法可行。應(yīng)用凝集素芯片分析經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞系和“靜態(tài)”LX-2細(xì)胞系糖蛋白糖鏈表達(dá)差異。得出以下初步結(jié)果：(1)肝纖維化的肝星狀細(xì)胞中T抗原/Tn抗原糖鏈結(jié)構(gòu)增加，T抗原或Tn抗原唾液酸化明顯。(2)發(fā)生肝纖維化的肝星狀細(xì)胞糖蛋白N-糖鏈分支結(jié)構(gòu)增加顯著，特別是Bisecting GlcNAc結(jié)構(gòu)。(3)核心巖藻糖結(jié)構(gòu)在纖維化肝星

5、狀細(xì)胞中主要以Fucoseα-1,6GlcNAc(core fucose)結(jié)構(gòu)存在，而且末端巖藻糖結(jié)構(gòu)升高。(4)MAL-Ⅱ特異性識別的Sia2-3Galβ1-4Glc(NAc)結(jié)構(gòu)主要存在于正常肝星狀細(xì)胞，而SNA特異性識別的Sia2-6Galβ1-4Glc(NAc)主要存在于纖維化肝星狀細(xì)胞。(5)GlcNAc、β1-4GlcNAc、Galβ-1,4GlcNAc結(jié)構(gòu)在纖維化肝星狀細(xì)胞中表達(dá)量升高，GalNAcβ-1,4GlcNAc結(jié)

6、構(gòu)則相對穩(wěn)定。(6)ConA、LCA在纖維化肝星狀細(xì)胞中信號增強(qiáng)，說明纖維化肝星狀細(xì)胞中α-甘露糖結(jié)構(gòu)增多。(7)根據(jù)WGA、PWM、STL、LEL、DSA顯示結(jié)果分析，在纖維化肝星狀細(xì)胞中GlcNAc及(GlcNAc)n(n=2，3)結(jié)構(gòu)減少，(GlcNAc)n(≥3)結(jié)構(gòu)增加。(8)根據(jù)PTL-Ⅱ、PTL-Ⅰ、BPL、VVA、SBA、SJA熒光信號強(qiáng)度分析，末端GalNAc和Gal結(jié)構(gòu)增加，同時αGalNAc結(jié)構(gòu)減少，Gal結(jié)構(gòu)增多