microRNA-146a通過(guò)Smad4調(diào)節(jié)TGF-β1誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞增殖.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是多種慢性致病因素作用于肝臟引起細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)過(guò)量沉積的創(chuàng)傷愈合過(guò)程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellates cell,HSC)的活化在肝纖維化發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用,激活的HSC是產(chǎn)生ECM的主要來(lái)源細(xì)胞。TGF-β1被認(rèn)為是主要的致HSC活化的細(xì)胞因子。近年來(lái)研究顯示microRNA(miRNA)廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分

2、化、凋亡等一系列重要生物學(xué)進(jìn)程。miR-146a是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與免疫功能相關(guān)的miRNA,miR-146a是否參與調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的HSC的活化目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究觀察miR-146a在HSC活化過(guò)程中和肝纖維化形成過(guò)程中的表達(dá)變化,并深入探討其對(duì)HSC活化增殖的影響及其作用的分子機(jī)制,以揭示干預(yù)HSC活化的新的作用靶點(diǎn)。
　　實(shí)驗(yàn)采用CCl4皮下注射建立大鼠肝纖維化模型,正常組10只、CCl4處理組15只。自處理之日開(kāi)

3、始,除正常組,其他各組雄性大鼠皮下注射50％CCl4植物油溶液(1ml/kg)每周2次,共12周;正常組給予同樣劑量花生油皮下注射。12周末,取肝組織進(jìn)行病理組織學(xué)和Masson膠原染色檢測(cè),并檢測(cè)α-SMA在大鼠肝組織中的表達(dá)變化。通過(guò)一步法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)不同濃度TGF-β1刺激的HSC和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化組織中miR-146a的表達(dá)。通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-146amimics(模擬物)到

4、大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6內(nèi)以觀察對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖的影響,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。體外培養(yǎng)的HSC,轉(zhuǎn)染60nMmiR-146amimics進(jìn)入細(xì)胞,6h后用TGF-β110ng/ml刺激細(xì)胞24h或48h后,利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法,細(xì)胞周期分析方法以及流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)觀察miR-146a對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC的增殖的影響。應(yīng)用生物信息方法發(fā)現(xiàn)Smad4是miR-146a的潛在靶點(diǎn)。利用RT-P

5、CR,real-timeqPCR和westernblots,分別檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的HSC中活化的標(biāo)志物α-SMA和Smad4mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：發(fā)現(xiàn)用不同濃度(0,5,10,15ng/ml)TGF-β1刺激HSC,miR-146a的表達(dá)呈劑量依賴性的下調(diào)。miR-146a在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化組織中表達(dá)也是下調(diào)的。與陰性對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染60nM的miR-146a模擬物進(jìn)入HSC可以明顯減少TGF-β1誘導(dǎo)的

6、α-SMA的表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-146a可以顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC的增殖,增加細(xì)胞凋亡。生物信息技術(shù)顯示Smad4是miR-146a的潛在靶點(diǎn)。在TGF-β1刺激的HSC中,miR-146a可以顯著降低Smad4蛋白水平的表達(dá),而不能降低其mRNA水平的表達(dá),提示miR-146a是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Smad4的表達(dá)。以上研究表明,miR-146a通過(guò)轉(zhuǎn)錄后抑制Smad4的表達(dá)參與調(diào)控TGF-β1誘導(dǎo)的HSC的增殖,這可能成為肝纖