TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)I型膠原蛋白的機(jī)制研究.pdf

1、肺纖維化是一種進(jìn)展快、病死率高和治療差的嚴(yán)重的肺間質(zhì)性疾病，目前尚缺乏有效防治手段，尋找有效的防治肺纖維化藥物有著重要意義。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）過(guò)度沉積在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中以膠原蛋白I（collagen I）最具代表性，因此研究collagen I沉積的具體機(jī)制對(duì)肺纖維化防治具有重要意義。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）普遍存在于體內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、抗凋亡、分化和細(xì)胞遷移等過(guò)程。已有研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路

2、參與到肺纖維化發(fā)生發(fā)展中，但其在TGF-β1誘導(dǎo)collagen I表達(dá)中的作用尚未完全闡明。近來(lái)研究表明，PIK3CD在慢阻肺和哮喘中高表達(dá)，且可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，這提示PIK3CD可能在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。鑒于PI3K在體內(nèi)的重要作用，針對(duì)PIK3CD特異性亞基在ECM過(guò)度沉積的研究可能對(duì)將來(lái)靶向治療肺纖維化提供新的切入點(diǎn)。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：CTGF在TGF-β1/PI3K誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)

3、胞表達(dá)collagen I中的作用。
　　目的：
　　研究CTGF在TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)collagen I中的作用及分子機(jī)制研究。
　　方法：
　?、挪煌瑵舛萒GF-β1（1ng/ml，5ng/ml，10ng/ml）刺激A549細(xì)胞不同時(shí)間（3h，6h，12h，24h，48h），qPCR和ELISA檢測(cè)collagen I及qPCR和western-blot檢測(cè)CTGF的表達(dá)情況，選擇最佳的TGF-

4、β1刺激濃度和刺激時(shí)間。⑵TGF-β1（5ng/ml）刺激A549細(xì)胞，western-blot檢測(cè)PI3K/AKT信號(hào)通路活化情況；并用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞2h，再TGF-β1（5ng/ml）刺激48h，觀察LY294002對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)collagen I和CTGF表達(dá)的影響。⑶siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24h，特異性干擾CTGF表達(dá)后，觀察其對(duì)A549細(xì)胞collagen I的基礎(chǔ)表達(dá)；siRNA轉(zhuǎn)染A54

5、9細(xì)胞24h，再TGF-β1（5ng/ml）刺激48h，qPCR和ELISA檢測(cè)collagen I表達(dá)的變化；siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24h，再TGF-β1（5ng/ml）刺激10min，western-blot檢測(cè)PI3K/AKT通路活化的情況。
　　結(jié)果：
　?、倥c對(duì)照組相比，TGF-β1組collagen I的mRNA和蛋白表達(dá)升高，隨著TGF-β1刺激時(shí)間和劑量的增加而升高，48h處表達(dá)最明顯；與對(duì)照組相比， T

6、GF-β1組CTGF的mRNA和蛋白早期即表達(dá)升高，在6h處升高最明顯，隨著TGF-β1劑量增加而升高。②與對(duì)照組相比，TGF-β1組AKT磷酸化增加；與TGF-β1刺激組相比， PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理組collagen I表達(dá)明顯降低，并隨著LY294002劑量增加而降低。③與對(duì)照組相比，siRNA干擾A549細(xì)胞CTGF表達(dá)后，collagen I基礎(chǔ)表達(dá)明顯減少；與TGF-β1組相比，siRNA+TGF-β1組col

7、lagen I表達(dá)顯著降低，兩組PI3K信號(hào)通路活化無(wú)差異。
　　結(jié)論：
　?、臫GF-β1誘導(dǎo)collagen I表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴性；TGF-β1誘導(dǎo)CTGF早期即刻表達(dá)，呈劑量依賴性。⑵TGF-β1誘導(dǎo)PI3K/AKT信號(hào)通路活化，LY294002部分逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的CTGF和collagen I表達(dá)升高。⑶siRNA干擾CTGF能降低collagen I基礎(chǔ)表達(dá)和TGF-β1誘導(dǎo)的collagen I表達(dá)升高

8、，而不影響PI3K/AKT信號(hào)通路活化。
　　第二部分：PIK3CD亞基在TGF-β1誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)collagen I中的作用。
　　目的：
　　篩選PI3K特異性亞基，并研究其在TGF-β1誘導(dǎo)A549細(xì)胞表達(dá)collagen I過(guò)程中的作用。
　　方法：
　?、臫GF-β1（5ng/ml）刺激A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)（3h，6h，12h，24h，48h）， qPCR檢測(cè)14種PI3K亞基的mRNA

9、表達(dá)情況，篩選特異性亞基。⑵TGF-β1（5ng/ml）刺激A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)（3h，6h，12h，24h，48h）， qPCR和western-blot檢測(cè)PIK3CD亞基的mRNA和蛋白表達(dá)情況。⑶PIK3CD特異性抑制劑Cal-101和PI3K總抑制劑LY294002預(yù)處理A549細(xì)胞2h，TGF-β1（5ng/ml）刺激A549細(xì)胞48h，qPCR和ELISA檢測(cè)collagen I表達(dá)情況。⑷shRNA-PK3CD轉(zhuǎn)染A5

10、49細(xì)胞24h， TGF-β1（5ng/ml）刺激A549細(xì)胞48h，qPCR和ELISA檢測(cè)collagen I表達(dá)情況。⑸Cal-101（11.06uM）、LY294002（10.74uM）、Cal-101（11.06uM）+TGF-β1（5ng/ml）和 LY294002（10.74uM）+TGF-β1（5ng/ml）處理A549細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)（6h，12h，24h，48h，72h），CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果

11、：
　?、贆z測(cè)14種亞基mRNA（PIK3CA，PIK3CB，PIK3CD，PIK3CG，PIK3R5， PIK3R1，PIK3R2，PIK3R3，PIK3R6，PIK3C2A，PIK3C2B，PIK3C2G，PIK3C3， PIK3R4），發(fā)現(xiàn)PI3KCD亞基顯著升高，并隨著時(shí)間增加而升高，于48h時(shí)表達(dá)最高，其他亞基變化無(wú)明顯差異；而后，對(duì) PIK3CD蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PIK3CD蛋白表達(dá)亦升高，呈時(shí)間依賴性，在48h表

12、達(dá)最明顯。②與TGF-β1組相比，Cal-101+TGF-β1和LY294002+TGF-β1組collagen I表達(dá)明顯降低，Cal-101+TGF-β1和LY294002+TGF-β1組之間無(wú)差異。與TGF-β1組相比，shRNA-PIK3CD+TGF-β1組collagen I表達(dá)明顯降低。③與對(duì)照組相比，Cal-101、LY294002、Cal-101+TGF-β1和LY294002+TGF-β1組細(xì)胞增殖均受抑制；同LY29