腺病毒E1A蛋白對大鼠肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子的影響及機(jī)制.pdf

1、兒童時期下呼吸道感染是慢性阻塞性肺疾病發(fā)病獨立的危險因素。下呼吸道感染的主要病原體是病毒，尤其是腺病毒。與其他病毒感染不同，腺病毒往往在急性期感染后形成潛伏感染狀態(tài)，病毒雖然停止復(fù)制但病毒DNA長期存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，并表達(dá)部分病毒蛋白，其中E1A蛋白是腺病毒潛伏感染后最主要表達(dá)的效應(yīng)蛋白。COPD最主要的病理特征是累及肺組織和氣道的慢性炎癥，所涉及的發(fā)病機(jī)制主要包括：炎癥機(jī)制、氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及凋亡機(jī)制，構(gòu)建了腺

2、病毒潛伏感染持續(xù)表達(dá)E1A蛋白的細(xì)胞模型，離體水平對E1A蛋白對細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化/抗氧化平衡、以及生理濃度糖皮質(zhì)激素抗炎作用的影響等方面進(jìn)行了研究。探討腺病毒潛伏感染在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用，為進(jìn)一步揭示COPD發(fā)病機(jī)制、尋找有效的COPD防治方法打下堅實基礎(chǔ)。 方法: 一、腺病毒E1A基因高效真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)E1A蛋白的大鼠肺泡上皮細(xì)胞株的構(gòu)建：目的基因E1A編碼序列用PCR方法獲得，模板為含

3、有腺病毒C屬5型基因組25到1770核苷酸序列的質(zhì)粒(Pneo-E1A)，將擴(kuò)增的E1A基因片段連接到pGEM-Teasy載體上，酶切、測序鑒定正確后，亞克隆至高效真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA<,3>、pEGFP-C<,2>上構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNA<,3>-E1A、pEGFP-C<,2>-E1A。最后對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序鑒定。將構(gòu)建成功的pCDNA<,3>-E1A、pEGFP-C<,2>-E1A重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠肺泡上皮細(xì)

4、胞，通過G418 抗性篩選和單克隆化操作最終獲得 4 個穩(wěn)定表達(dá)E1A蛋白的抗性細(xì)胞克隆，進(jìn)一步用RCR、RT-PCR、Western-Blot及免疫組化的方法對E1A基因表達(dá)進(jìn)行鑒定。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及增殖曲線、流式細(xì)胞周期分析E1A蛋白對細(xì)胞形態(tài)學(xué)及增殖周期的影響。 二、腺病毒E1A基因?qū)Υ笫蠓闻萆掀ぜ?xì)胞炎癥因子的影響及其機(jī)制：1、10m9．L<'-1>LPS和10pg．L<'-1>TNFα作用E1A陽性組細(xì)胞和對照組細(xì)胞，

5、分別于刺激因素作用24小時后收集細(xì)胞上清和細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞因子IL-6、TNFα、ICAM-1蛋白水平的測定；并于刺激因素作用前、作用后3、6、12小時收集細(xì)胞mRNA進(jìn)行RT-PCR檢測IL-6、TNFα、ICAM-1 mRNA水平的表達(dá)。2、將轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB熒光報道質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染E1A陽性組和對照組細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染12小時后分別加入刺激因素LPS、TNFα作用12小時后收集細(xì)胞檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性及細(xì)胞裂解液中蛋白濃度

6、，用蛋白濃度較正測定的熒光素酶活性值，得到校正熒光素酶活性值。3、根據(jù)大鼠ICAM-1基因上游調(diào)控序列設(shè)計 AP-1、NF-κB寡核苷酸探針，利用上述探針、競爭探針和大鼠肺泡上皮細(xì)胞核蛋白進(jìn)行EMSA實驗，確定ICAM-1基因上游調(diào)控區(qū)域的功能元件與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性。4、利用轉(zhuǎn)錄因子NF-кB抑制劑TPCK處理E1A陽性組和對照組細(xì)胞后，加入刺激因素LPS、TNFα作用24小時后收集細(xì)胞進(jìn)行ICAM-1蛋白表達(dá)的測定，明確轉(zhuǎn)錄因子NF

7、-кB在：ICAM-1基因表達(dá)中的作用。 三、E1A蛋白對TNFα誘導(dǎo)下細(xì)胞凋亡的影響：用Hoechest熒光染色及PI、結(jié)合膜聯(lián)蛋白V-FITC雙染法觀察30pg．L<'-1>TNFα作用E1A陽性組細(xì)胞和對照組細(xì)胞8小時后細(xì)胞的凋亡情況。 四、腺病毒ElA蛋白對轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-кB轉(zhuǎn)錄活性的影響及氧化/抗氧化失衡對其的影響：1、刺激因素LPS和TNFα作用E1A陽性組細(xì)胞和對照組細(xì)胞，分別于刺激因素作用前、作

8、用后30分鐘、1小時、4小時收集細(xì)胞核蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-кB活化蛋白表達(dá)的免疫印記檢測，同時收集細(xì)胞總蛋白對轉(zhuǎn)錄因子NF-кB總蛋白表達(dá)進(jìn)行免疫印記檢測。2、用抗氧化物質(zhì)NAC以及GSH合成酶抑制劑BSO預(yù)處理E1A陽性組細(xì)胞及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，再加入LPS和TNFα作用細(xì)胞4小時，收集細(xì)胞核蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子NF-кB活化蛋白表達(dá)的免疫印記檢測。 五、腺病毒E1A蛋白對生理濃度的糖皮質(zhì)激素抗炎作用的影響及其機(jī)制：

9、1、用生理濃度的糖皮質(zhì)激素預(yù)處理CCL149細(xì)胞后在加入致炎因素LPS，ELISA法檢測炎性因子IL-6蛋白表達(dá)的影響；2、用生理濃度下糖皮質(zhì)激素、HDAC抑制劑(TSA)預(yù)處理CCL149細(xì)胞后再加入LPS，ELISA法檢測細(xì)胞IL-6蛋白的表達(dá)；3、比色法檢測LPS、HDAC抑制劑以及生理濃度下糖皮質(zhì)激素作用CCL149細(xì)胞后，細(xì)胞HDAC活性的變化；4、ELISA法檢測生理濃度的糖皮質(zhì)激素對E1A組陽性細(xì)胞和對照組細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)

10、下IL-6蛋白表達(dá)的影響；5、比色法檢測致炎因素LPS、HDAC抑制劑以及生理濃度下糖皮質(zhì)激素對E1A陽性組細(xì)胞和對照細(xì)胞HDAC活性的影響。 結(jié)果: 一、成功克隆出E1A基因完全編碼區(qū)基因序列，構(gòu)建含E1A基因完全編碼區(qū)的重組質(zhì)粒pCDNA<,3>－E1A、，pEGFP-C<,2>－E1A。將重組質(zhì)粒與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCL149細(xì)胞后經(jīng)G418抗性篩選，E1A組共得到94個抗性細(xì)胞克隆，其中有9個細(xì)胞克隆經(jīng)PCR檢測能擴(kuò)

11、增出1 560 bp的基因片段，進(jìn)一步RT-PCR檢測有4個細(xì)胞克隆能擴(kuò)增出E1A基因486bp特異性片段，而對照質(zhì)粒組細(xì)胞和正常大鼠肺泡上皮細(xì)胞均無特異性條帶顯示；4個RT-PCR陽性的細(xì)胞克隆行免疫組化結(jié)果顯示：E1A陽性的細(xì)胞克隆均在細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)胞染色，而對照質(zhì)粒組細(xì)胞和正常大鼠肺泡上皮細(xì)胞均未見陽性染色；Western-Blot結(jié)果顯示：4個E1A陽性細(xì)胞克隆均出現(xiàn)大小約為45～48、50～52 kDa E1A特異性的蛋

12、白條帶，而對照質(zhì)粒組與正常大鼠肺泡上皮細(xì)胞均未出現(xiàn)特異性蛋白條帶。因此穩(wěn)定表達(dá)E1A蛋白的大鼠肺泡上皮細(xì)胞株構(gòu)建成功。通過細(xì)胞增殖曲線及流式細(xì)胞增殖周期的觀察發(fā)現(xiàn)：與對照細(xì)胞相比E1A組細(xì)胞增殖時間明顯延長；細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)：與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，E1A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)明顯的S期縮短、G<,1>期延長，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化表現(xiàn)為：細(xì)胞生長趨向為集簇狀，細(xì)胞核增大，細(xì)胞體積變小。 二、在刺激因素LPS、TNFα作用下，E1A陽性組與對

13、照質(zhì)粒組在細(xì)胞因子IL-6、TNFα的mRNA、蛋白表達(dá)方面無明顯差別；而細(xì)胞因子ICAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)在E1A組明顯高于對照組；轉(zhuǎn)錄因子熒光報道系統(tǒng)顯示：在刺激因素作用前后轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-кB轉(zhuǎn)錄活性在E1A組均明顯高于對照組；進(jìn)一步作轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-кB在 ICAM-1基因上游調(diào)控序列功能元件結(jié)合活性的EMSA，結(jié)果顯示：與對照組相比，E1A組在刺激因素作用后NF-кB與ICAM-1基因上游調(diào)控元件結(jié)合活性

14、明顯增高；而AP-1與ICAM-1基因上游調(diào)控元件結(jié)合活性無明顯變化。NF-кB抑制劑TPCK能完全阻斷E1A上調(diào)ICAM-1蛋白表達(dá)的作用。因此，腺病毒E1A蛋白上調(diào)ICAM-1表達(dá)的機(jī)制主要是通過轉(zhuǎn)錄因子NF-кB實現(xiàn)的。 三、細(xì)胞凋亡分析發(fā)現(xiàn)：在30pg．L<'-1>TNFα作用下，E1A陽性組凋亡細(xì)胞明顯增多，與對照相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義。 四、免疫印記結(jié)果顯示：刺激因素LPS、TNFα作用后，E1A陽性組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄

15、因子AP-1核轉(zhuǎn)錄活性與對照質(zhì)粒組相比，差別無明顯顯著性；而轉(zhuǎn)錄因子NF-кB核轉(zhuǎn)錄活性在E1A陽性組明顯高于對照組；BSO處理細(xì)胞后能明顯增加E1A上調(diào)NF-кB核轉(zhuǎn)錄活性的作用；抗氧化劑NAC能明顯抑制E1A上調(diào)NF-кB核轉(zhuǎn)錄活性的作用；相對與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，E1A對NF-кB總蛋白表達(dá)無明顯影響。因此，腺病毒E1A蛋白在不影響NF-кB總蛋白表達(dá)的情況下能明顯上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-кB轉(zhuǎn)錄活性，腺病毒E1A蛋白能明顯降低細(xì)胞對氧化/

16、抗氧化失衡的耐受性，活化NF-кB轉(zhuǎn)錄活性的作用。 五、生理濃度的糖皮質(zhì)激素能明顯抑制CCL149細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下IL-6蛋白的表達(dá)；HDAC抑制劑TSA能完全抑制糖皮質(zhì)激素的抗炎作用。通過測定CCL149細(xì)胞HDAC活性顯示：刺激因素LPS能顯著降低細(xì)胞HDAC活性，而生理濃度的糖皮質(zhì)激素能恢復(fù)細(xì)胞HDAC的活性。證實生理濃度糖皮質(zhì)激素有一定抗炎作用，而這一作用的發(fā)揮重要是通過HDAC來實現(xiàn)的；進(jìn)一步檢測E1A陽性組與對照質(zhì)

17、粒組細(xì)胞HDAC活性，結(jié)果顯示：兩組在各處理因素作用下，細(xì)胞HDAC活性無顯著差別，E1A蛋白對生理濃度糖皮質(zhì)激素抗炎作用無明顯影響。 結(jié)論: 1、腺病毒E1A蛋白能夠放大致炎因素誘導(dǎo)下炎癥因子ICAM-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)。E1A蛋白主要通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-кB的轉(zhuǎn)錄活性，增加NF-кB與ICAM-1基因上游調(diào)控元件的結(jié)合來增加ICAM-1基因的表達(dá)。 2、E1A蛋白能夠增加細(xì)胞對致凋亡因素的敏感性，