TGF-β1在三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化中的作用與分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 上世紀(jì)70年代末，上海血研所王振義教授率先應(yīng)用全反式維甲酸(all-transretinoic acid,ATRA)誘導(dǎo)分化治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocyticleukemia，APL)獲得成功。使APL由預(yù)后極差的一類白血病亞型轉(zhuǎn)變?yōu)榭赡苤斡募膊?，成為腫瘤誘導(dǎo)分化治療中最為成功的范例[1]。但是隨后發(fā)現(xiàn)單一應(yīng)用ATRA治療APL存在的一些不足：如治療過程易出現(xiàn)維甲酸綜合征(RAS

2、)、耐藥及緩解后復(fù)發(fā)率高等。三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)作為傳統(tǒng)中藥砒霜的主要有效成分，我國傳統(tǒng)中醫(yī)很早就對其性質(zhì)做了描述，數(shù)百年前即有應(yīng)用砷化物用于治療腫瘤的記載。1992年哈醫(yī)大一附院開始單一應(yīng)用As2O3治療APL取得了顯著的臨床效果，完全緩解率(CR)達(dá)65％-98％[2]。并且對ATRA耐藥及復(fù)發(fā)的APL患者同樣具有很好的治療效果，目前As2O3已廣泛應(yīng)用于血液系統(tǒng)腫瘤的臨床治療。ATRA聯(lián)合As

3、2O3,已成為APL治療的標(biāo)準(zhǔn)方案之一。研究表明As2O3對急性白血病細(xì)胞作用與藥物濃度相關(guān)：高濃度時(shí)主要促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，低濃度時(shí)則以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化為主，這一特性在APL細(xì)胞中最為明顯。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)As2O3對早幼粒白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞表現(xiàn)出劑量依賴的雙重作用：高濃度觸發(fā)細(xì)胞凋亡，可能與As2O3損害線粒體功能，激活細(xì)胞凋亡蛋白酶有關(guān)；而在低濃度可以誘導(dǎo)細(xì)胞部分分化，其機(jī)制可能與降解PML-RARα融合蛋白，恢復(fù)維甲酸信號通路有

4、關(guān)[3]。
　　 隨著研究的不斷深入，科研人員發(fā)現(xiàn)砷劑對其他類型白血病細(xì)胞株及實(shí)體腫瘤細(xì)胞亦具有廣泛的抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用。提示維甲酸受體通路并非砷劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的惟一通路，可能存在其他信號通路。同時(shí)盡管As2O3在白血病的臨床治療中已取得明顯效果，但是在誘導(dǎo)分化治療紅白血病方面研究進(jìn)展相對緩慢。在此情況下我們通過建立As2O3誘導(dǎo)紅白血病細(xì)胞系K562分化模型來進(jìn)一步探討As2O3誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的作用機(jī)制，以探索其抗

5、腫瘤機(jī)制中的作用靶點(diǎn)。為以后通過與相關(guān)靶向藥物聯(lián)合應(yīng)用治療紅白血病，以達(dá)到更好的治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　 As2O3作為一種誘導(dǎo)分化藥物，其對APL的治療取得顯著療效，但是在誘導(dǎo)分化治療紅白血病方面進(jìn)展相對緩慢。在這種情況下，我們通過建立小劑量As2O3誘導(dǎo)紅白血病細(xì)胞系K562分化模型，研究wilms瘤基因(wilms'tumor gene，WT1)、轉(zhuǎn)化生長因子-beta1(transforming growth

6、 factor-β1，TGF-β1)在誘導(dǎo)分化過程中的變化及其調(diào)控關(guān)系。初步探討As2O3誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的分子學(xué)機(jī)制。為以后探索其抗腫瘤機(jī)制中的作用靶點(diǎn)，聯(lián)合作用于相關(guān)靶點(diǎn)的靶向藥物，以達(dá)到更好的治療效果提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 首先建立小劑量As2O3(1.0μmol/L)誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化模型，然后油境下觀察K562細(xì)胞形態(tài)變化；應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)方法測定As2O3對細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)

7、胞周期；RT-PCR方法檢測EVI1及WT1，TGF-β1在mRNA水平的表達(dá)的變化。采用基因沉默技術(shù)干擾WT1及早期生長反應(yīng)基因(early growth response1，EGRl)的表達(dá)，觀察下游基因TGF-β1的變化。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.0μmol/L As2O3對K562細(xì)胞誘導(dǎo)72h后，可觀察到G0/G1期細(xì)胞所占百分比值升高，G2/M期細(xì)胞百分比數(shù)值下降；1.0μmol/L As2O3處理K56

8、2細(xì)胞0h、24h、48h、72h后EVI1及WT1表達(dá)降低，條帶逐漸變暗，TGF-β1表達(dá)升高，條帶逐漸變亮。WT1基因沉默后TGF-β1表達(dá)升高，條帶逐漸變亮。而EGR1基因沉默后TGF-β1表達(dá)未受影響，條帶亮度無明顯變化。其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。結(jié)論
　　 小劑量As2O3對K562細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)與EVI1和WT1基因表達(dá)下調(diào)，TGF-β1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。應(yīng)用WT1siRNA干擾K562細(xì)胞WT1基因表達(dá)后可