布魯氏菌外膜蛋白免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)(簡稱布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的人、畜共患傳染病，在我國被列為二類傳染病。世界上170多個國家和地區(qū)有人、畜布病的存在和流行。在我國布病波及28個省市區(qū)，并且近年來死灰復(fù)燃，給畜牧業(yè)和人類的健康帶來嚴重危害。 布魯氏菌包括新發(fā)現(xiàn)的海洋哺乳動物種在內(nèi)，有7種21個生物型，感染人的主要有牛、羊、豬、犬和新發(fā)現(xiàn)的海洋種。布魯氏菌屬革蘭氏陰性菌，兼性寄生于巨噬細胞內(nèi)，從而逃避宿主的免

2、疫清除。它主要引起人的波狀熱和慢性感染，造成反芻動物不育和流產(chǎn)等，同時又是一種潛在的生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。 因布病獨特的致病機制和感染后難以根治的特點，疫苗一直在布病的綜合防治措施中占有極為重要的地位。其中減毒活疫苗應(yīng)用較早至今仍占主要地位，但在安全性和有效性方面仍存在很多問題。隨著羊種、豬種和牛種布魯氏菌基因組測序的完成和反向疫苗學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，使布病疫苗研究進入“后基因組學(xué)”時代。“后基因組學(xué)”時代迫切需要解決現(xiàn)有疫苗的

3、缺陷，即“安全性不足”和“保護效力有限”。目前研究表明布魯氏菌重組亞單位疫苗能產(chǎn)生一定的免疫原性和免疫保護性，但是目前發(fā)現(xiàn)的分子保護效果不完全，提示還有新的保護性抗原沒有被發(fā)現(xiàn)，因此找到布病疫苗新靶標是發(fā)展新一代疫苗的重大科學(xué)問題。基于以上思路，本研究對我國羊種布魯氏菌五號菌種簡稱M5的外膜蛋白進行免疫蛋白質(zhì)組學(xué)的初步研究，以期篩選布魯氏菌保護性抗原分子，為安全、有效的布魯氏菌重組亞單位疫苗研制提供保證。本研究的主要內(nèi)容包括以下幾方面：

4、 (1)制備布魯氏菌免疫血清(兔血清)，然后制備布魯氏菌M5的外膜蛋白樣品，通過雙向電泳分離外膜蛋白質(zhì)樣品，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，利用兔血清通過Western blot來探測免疫蛋白點。21個免疫蛋白點經(jīng)膠內(nèi)酶切、肽提取后用基質(zhì)輔助激光解析/電子飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)進行鑒定。每個蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜用Mascot進行檢索后，代表了12個開放閱讀框。這些蛋白不全是外膜蛋白，還存在胞漿蛋白，其功能涉及生物

5、合成和物質(zhì)代謝等領(lǐng)域，還有一個功能未知的蛋白。結(jié)果成功建立了布魯氏菌外膜蛋白的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，不僅驗證了傳統(tǒng)使用的抗原，同時也鑒定了新的免疫分子。為尋找保護性抗原分子及新型疫苗抗原候選提供新思路。 (2)通過文獻調(diào)研和生物信息學(xué)的分析，本部分選取5個免疫蛋白基因，進行PCR擴增目的片段，分別構(gòu)建在原核表達載體pET32a上，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，經(jīng)誘導(dǎo)表達、純化相應(yīng)的蛋白，結(jié)果成功的誘導(dǎo)表達了4個免疫蛋白并進行了Wes

6、tern blot的鑒定具有反應(yīng)原性。其中一個未誘導(dǎo)成功，條件正在摸索中。同時將5個蛋白基因構(gòu)建到真核表達載體pVAX1上，轉(zhuǎn)染COS-7細胞后驗證有目的蛋白表達，大提質(zhì)粒制各相應(yīng)的候選DNA疫苗，構(gòu)建基因工程疫苗。免疫Balb/c小鼠，共免疫3次，前2次用重組基因產(chǎn)物免疫，后1次用相應(yīng)重組蛋白產(chǎn)物加強免疫。通過ELISA、ELISPOT、FCM及MTT來檢測疫苗在免疫小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液及細胞免疫指標。結(jié)果表明DNA候選疫苗可同時激