布魯氏菌部分外膜蛋白基因的克隆、表達及免疫原性研究.pdf

1、布魯氏菌是革蘭氏陰性的兼性細胞內寄生菌，可以引發(fā)世界范圍內人和牲畜及野生哺乳動物的感染，也是生物武器研究的熱點。布魯氏菌引發(fā)的傳染性疾病和巨大的經濟損失已經引起全世界的關注。 補體結合實驗，玫瑰花環(huán)實驗，血清凝集實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗等經典血清學診斷均依賴布魯氏菌脂多糖作為抗原檢測相應抗體，主要存在以下的缺陷：1、布魯氏菌脂多糖與其他的革蘭氏陰性細菌的脂多糖存在交叉反應，在檢測過程中可能出現(xiàn)假陽性的結果；2.不能根據(jù)血清學檢驗鑒

2、別天然感染和接種過疫苗。因此尋找蛋白抗原成為解決布魯氏菌的診斷中存在的這些缺陷的主要方向。 目前減毒活菌疫苗是預防布魯氏菌的主要手段，但是由于減毒活疫苗可能存在毒力回復以及隱性感染等危險，一直未能應用于人類的布魯氏菌預防。而且和其他細胞內寄生細菌一樣，布魯氏菌的LPS具有較低的免疫原性，不能引發(fā)足夠清除病原的免疫反應，是布魯氏菌能夠在宿主細胞內存活并繁殖的一個重要原因，因此尋找蛋白性質的抗原具有重要的意義。 國外的研究工

3、作已經對一些布魯氏菌的外膜蛋白進行了免疫原性和保護性的研究，期待能夠應用于布魯氏菌診斷和亞單位疫苗的制備。其中OMOP31、OMP10和bp26均為強免疫原性蛋白并具有保守的DNA序列。尤其是bp26在一些疫苗株中的弱化和缺失對于鑒別天然感染和疫苗接種具有現(xiàn)實意義。 在此次研究中我們自布魯氏菌基因組中擴增獲得OMP31、OMP10和bp26的基因片斷并克隆至原核表達載體PGEX-4T-1，經IPTG誘導之后成功表達了上述三種蛋白

4、，分別命名為GST-OMP31,GST-OMP10和GST-bp26。并通過western-blotting實驗檢測其免疫特性，結果顯示三種蛋白均能夠被布魯氏菌感染兔血清特異性識別，而載體蛋白與陽性血清并不能產生反應，證明這三種蛋白具有良好的抗原特異性，可期待應用于布魯氏菌的診斷。 根據(jù)這三種蛋白不同的理化特性，我們采用了不同的純化方式進行了蛋白的純化，其中GST-OMP31和GST-bp26獲得了良好的純化效果，而OMP10在

5、純化的過程中未能夠保持穩(wěn)定，發(fā)生了降解。 純化后的GST-OMP31和GST-bp26蛋白分三次，第一次使用完全弗氏佐劑，后兩次采取不完全弗氏佐劑作為佐劑免疫小鼠。兩種蛋白均能誘導高滴度的體液免疫。通過淋巴細胞增殖實驗、細胞因子分析和CD4+、CD8+和CD86+淋巴細胞亞群分析，結果顯示GST-OMP31免疫小鼠脾細胞經GST-OMP31刺激之后可以產生IFN-γ而不是IL-4，提示GST-OMP31誘導的是Th1型免疫反應。

6、并且能夠誘導特異性細胞毒反應，導致提呈抗原的巨噬細胞的溶解凋亡。此外，小鼠體內CD4+和CD8+淋巴細胞記數(shù)的減少提示，GST-OMP31免疫誘導小鼠CD4+淋巴細胞產生IFN-γ從而誘導產生CD8+T細胞的特異性細胞毒作用。結果顯示，OMP31誘導的免疫主要由CD4+淋巴細胞產生，而CD8+淋巴細胞的作用因此而收到了限制。 GST-bp26相對于GST-OMP31來說不僅能夠誘導Th1型免疫反應，產生干擾素和特異性細胞毒細胞，

7、也能夠誘導Th2型免疫反應，產生IL-4和TNF-α。淋巴細胞增殖實驗和CD4+、CD8+和CD86+淋巴細胞亞群分析結果顯示，Th1型和Th2型免疫反應的相互拮抗作用使GST-bp26相對于GST-OMP31來說能夠維持更長時期的免疫保護作用。 和其他細胞內寄生菌一樣，激活的巨噬細胞對于宿主清除感染病原來說是非常重要的。TNF-α能夠激活巨噬細胞和促進炎癥反應，酶聯(lián)免疫吸附測定細胞因子結果顯示，GST-OMP31誘導TNF-α