乙型肝炎多表位抗原基因的克隆表達及免疫原性研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)是一種DNA病毒，屬嗜肝DNA病毒科，HBVDNA的基因組約含3200個堿基對，為環(huán)狀部分雙鏈DNA。它包括兩個鏈，一個長度固定的負鏈和另一長度不定的正鏈。HBVDNA負鏈有四個開放區(qū)，分別稱為S、C、P及X，編碼全部已知的HBV蛋白質。S區(qū)可分為二部分，S基因和前S基因。S基因編碼主要表面蛋白。S基因之前是一個能編碼163個氨基酸的前S基因，編碼PreS1和PreS2蛋白。C區(qū)基因包括前C基因和C基因，分別編碼H

2、BeAg和HBcAg。P區(qū)最長，約占基因組75％以上，編碼病毒體DNA多聚酶。X區(qū)可能編碼有154個氨基酸的堿性多肽，長鏈的裂口位于此區(qū)。 HBV是病毒性乙型肝炎的病原體，據(jù)估計全世界有2.8億HBV攜帶者，我國占1億左右，其中2/3為無癥狀攜帶者。大規(guī)模乙型肝炎疫苗接種是預防HBV感染的有效措施，但仍有約10％-20％的個體對疫苗無反應性。 特異性免疫治療途徑，因其能增強慢性HBV感染者的T細胞應答的作用，被期待發(fā)展為

3、新的慢性肝病治療方法。細胞毒性T淋巴細胞反應(CTL反應)是HBV感染的一種主要防御機制，CTL疫苗可同時誘導抗HBV的體液免疫和細胞免疫，比僅可誘發(fā)體液免疫的疫苗具有更好的免疫效果和保護性，可望解決目前HBV疫苗免疫的無應答性。鑒于此，從HBV基因組中優(yōu)選了5個具有良好免疫原性的高度保守的HLA識別表位，組合成了一個多表位抗原基因BPT。這些表位分別來自HBV前S2區(qū)、HBV表面抗原、HBV核心抗原、HBVDNA多聚酶，此外還加入了強

4、的輔助免疫原PADRE和CpG島核心序列。整個基因的設計注重細胞免疫功能的發(fā)揮和T細胞和B細胞的協(xié)調作用，從理論上講更符合機體的抗HBV免疫機制，為表位疫苗激發(fā)有效免疫應答奠定了良好基礎。 BPT基因與β-半乳糖酐酶基因融合后在E.coli中表達出融合蛋白P-BPT，Western-blotting結果顯示HBV患者血清可特異識別P-BPT融合蛋白，而不識別載體pWR450-1所表達的β-半乳糖酐酶蛋白，提示該蛋白具有乙型肝炎病

5、毒抗原的活性位點和較好的抗原性。 P-BPT蛋白免疫小鼠后，效靶比為100：1時，可有效誘發(fā)特異性CTL應答；P-BPT蛋白免疫后，可顯著刺激小鼠脾淋巴細胞增值；CD4+T淋巴細胞和細胞因子IFN-γ的增殖和分泌水平亦有明顯升高，顯示該融合蛋白可有效誘導小鼠免疫應答。 BPT基因克隆入pBAD/gⅢA-Top10原核非融合表達系統(tǒng)，阿拉伯糖誘導表達游離的HBV多表位抗原蛋白B-BPT，Western-blotting檢測

6、顯示該蛋白具有良好抗原性。B-BPT蛋白免疫小鼠后，可誘發(fā)血清特異性抗B-BPT免疫應答，最高滴度為105，對細胞免疫反應也有促進作用，使免疫小鼠殺傷活性增強，誘發(fā)特異性遲發(fā)性超敏反應，提示B-BPT蛋白在小鼠體內可以激發(fā)一定程度的特異性體液免疫和細胞免疫應答。 構建了BPT重組真核表達載體pcDNA3.1/BPT，經脂質體法轉染BALB/c小鼠3T3細胞，并用RT-PCR、間接免疫熒光法和Western-blotting等方法

7、鑒定了pcDNA3.1/BPT在BALB/c小鼠3T3細胞的轉錄和表達。重組質粒免疫小鼠后，于第2周特異性抗體開始升高、至第9周升至最高，10周開始略有下降。在效靶比為100：1時，可誘導特異性CTL應答。在融合蛋白P-BPT刺激下，免疫小鼠脾淋巴細胞增值顯著。半定量RT-PCR分析表明，IL-12mRNA的水平亦明顯升高。 治療性疫苗是目前乙肝研究的一個重要方向。多肽疫苗雖已在實驗研究中表現(xiàn)出理想的效果，但是多肽合成價格非常之