布魯氏菌外膜蛋白Omp15的原核表達(dá)及免疫活性鑒定.pdf

1、布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，給畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的健康帶來(lái)了很大危害。準(zhǔn)確的診斷是有效控制和消滅布魯氏菌病的前提，但目前常用的布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法不能區(qū)分是疫苗免疫還是自然感染后引起的血清學(xué)反應(yīng)。研制具有標(biāo)記性的疫苗或?qū)ふ液线m的布魯氏菌診斷性抗原一直是人們的目標(biāo)，所以具有免疫原性和抗原保護(hù)作用的布魯氏菌外膜蛋白就成了研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)從GenBank中下載編碼布魯氏菌外膜蛋白的基因，用BLAST分析后選取與布魯氏菌豬

2、、牛、羊這三種生物型基因序列的同源性高又與其他革蘭氏陰性細(xì)菌沒(méi)有交叉反應(yīng)的基因，同時(shí)對(duì)目的基因編碼的蛋白質(zhì)用TMHMM和ConPredⅡ軟件進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)的分析后，選取沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)且全部在膜外的蛋白進(jìn)行研究。本試驗(yàn)依據(jù)以上條件選取了羊布魯氏菌16M預(yù)測(cè)的分泌性蛋白質(zhì)Omp15對(duì)其進(jìn)行初步研究。 本試驗(yàn)采用降落PCR方法，以滅活的羊布魯氏菌16M的基因組為模板，擴(kuò)增出大約423bp的基因片段，將目的基因片段用限制性內(nèi)切酶Ba

3、mHI、EcoR I雙酶切后直接與同樣雙酶切的表達(dá)載體pGEX-4T-2連接，將該片段克隆于原核表達(dá)載體pGEX-4T-2中，之后將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21。經(jīng)重組載體的菌液:PCR鑒定、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定和測(cè)序鑒定:證明成功擴(kuò)增出了目的基因，并且將其成功重組到了表達(dá)載體pGEX-4T-2中。重組菌在0.5 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)后5h目的蛋白質(zhì)表達(dá)量達(dá)到了高峰。表達(dá)融合蛋白質(zhì)分子量約為41kDa，以包涵體形式存在

4、。以不同濃度尿素洗滌包涵體，然后用8M尿素溶解，電洗脫方法純化融合蛋白質(zhì)。用western-blotting分析重組表達(dá)的融合蛋白質(zhì)Ompl5的反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)該蛋白能與豚鼠的布魯氏菌陽(yáng)性血清發(fā)生較強(qiáng)烈反應(yīng)。進(jìn)而用電洗脫方法純化了該蛋白質(zhì)，并將其作為抗原包被，用豚鼠的布魯氏菌陽(yáng)性血清為一抗，兔抗豚鼠IgG為二抗，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，進(jìn)一步探索獲得的蛋白質(zhì)作為診斷蛋白的可能性。 本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pGEX-4T-2/Ompl5重組載體