犬布魯氏菌流行病學(xué)調(diào)查及其外膜蛋白Omp31原核表達與ELISA抗體檢測方法研究.pdf

1、犬布魯氏菌首次由美國學(xué)者Carmichael在1966年從200例流產(chǎn)的比格犬中分離得到的，此后日本、德國、巴西、墨西哥、阿根廷、美國、捷克和中國也相繼報道了犬布魯氏菌感染和病原分離的情況。此菌可引起狗的流產(chǎn)和小范圍的人得布病，還可感染猴和兔。布病是重要的人畜共患病，近年來在國內(nèi)人畜間感染率有上升趨勢，犬布病在全國大部分省區(qū)都有不同程度的感染。本試驗調(diào)查了我國部分地區(qū)的犬布魯氏菌病流行情況，并通過對犬布魯氏菌外膜蛋白基因Omp31的表達

2、，初步建立了犬布病血清間接ELISA檢測方法。
　　 （1）犬布魯氏菌流行病調(diào)查：本試驗從城區(qū)、農(nóng)區(qū)和牧區(qū)分別采集犬血清820份、全血10份和脾臟28份，血清分別用光滑型和粗糙型虎紅平板凝集試驗（RBT）進行初檢，初檢陽性血清用光滑型和粗糙型試管凝集試驗（SAT）和間接酶聯(lián)免疫試驗（iELISA）檢測；全血和脾臟進行病原分離鑒定。結(jié)果光滑型和粗糙型RBT陽性數(shù)分別為37份和9份，陽性率分別為4.5％和1.1％，光滑型和粗糙型SA

3、T陽性數(shù)分別為27份和7份，陽性率分別為3.3％和0.85％，間接ELISA陽性數(shù)16份和陽性率為2.0％。從脾臟中分離到一株菌株，并通過生化試驗、噬菌體分型及PCR鑒定，確認(rèn)為一株犬種布魯氏菌。
　　 （2）犬種布魯氏菌外膜蛋白Omp31基因原核表達和鑒定：根據(jù)GenBank上提供的基因序列設(shè)計引物，利用PCR技術(shù)擴增犬種布魯氏菌RM6/66標(biāo)準(zhǔn)株Omp31基因，連接到pGEM-TEasy載體上并測序，將該基因插入到pET-3

4、2a載體中成功構(gòu)建原核表達載體pET-Omp31，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，誘導(dǎo)表達融合蛋白，經(jīng)WesternBlot鑒定該蛋白能被犬布魯氏菌陽性血清所識別。
　　 （3）重組蛋白pET-Omp31的純化和犬布病血清ELISA檢測方法初步建立：重組蛋白pET-Omp31經(jīng)大量誘導(dǎo)表達，以包涵體形式存在，8mol/L尿素4℃過夜溶解包涵體，經(jīng)鎳離子柱純化后的目的蛋白作為抗原包被聚苯乙烯反應(yīng)板，抗原的最適包被濃度為49μg/m