18647.mitofilin蛋白下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

1、Mitofilin蛋白下調(diào)蛋白下調(diào)誘導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究機(jī)制研究StudyontheMechanismofCellApoptosisInducedbyDownregulationMitofilin學(xué)科專業(yè)：制藥工程研究生：王珊指導(dǎo)教師：楊曉明教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一二年五月摘要Mitofilin是線粒體重要的內(nèi)膜嵴形態(tài)維持蛋白，干涉Mitofilin的表達(dá)，細(xì)胞凋亡增加，但對(duì)其影響凋亡的具體機(jī)制稍不明確。本研究以此為切入點(diǎn)

2、，進(jìn)行了對(duì)其下調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究。本論文首先對(duì)Mitofilin的功能進(jìn)行了研究，構(gòu)建了Mitofilin的慢病毒干涉載體，并且獲得了干涉Mitofilin的穩(wěn)定細(xì)胞株。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)，激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，透射電子顯微鏡觀察線粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)變化，并且利用特異性染料標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)分子，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Mitofilin的表達(dá)，線粒體功能損傷。進(jìn)一步檢測(cè)了Mitofilin蛋白下調(diào)介

3、導(dǎo)的細(xì)胞行為學(xué)效應(yīng)。正常條件下，下調(diào)Mitofilin的表達(dá)，細(xì)胞凋亡比例增加。本實(shí)驗(yàn)利用依托泊苷(10μgmL)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，檢測(cè)了過(guò)表達(dá)和干涉Mitofilin細(xì)胞凋亡變化。實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)酵母雙雜交陣列篩選和GST沉降技術(shù)發(fā)現(xiàn)Mitofilin和Tim23存在蛋白質(zhì)相互作用。本研究通過(guò)外源和內(nèi)源免疫共沉淀證實(shí)Mitofilin與Tim23存在相互作用。進(jìn)一步構(gòu)建了Mitofilin和Tim23的截短體，并且通過(guò)GST沉降實(shí)驗(yàn)確定了兩

4、者相互作用的區(qū)段。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了回轉(zhuǎn)Tim23及其相應(yīng)缺失體后，細(xì)胞凋亡的變化情況，并且利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了Mitofilin對(duì)Tim23穩(wěn)定性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Mitofilin可以減少依托泊苷刺激下的細(xì)胞凋亡，并有效抑制Tim23的降解；相反，干涉Mitofilin可以加快細(xì)胞凋亡進(jìn)程，加速Tim23的降解，但是體系中回轉(zhuǎn)Tim23，凋亡比例有所下降，而回轉(zhuǎn)Tim23的缺失體后，細(xì)胞凋亡無(wú)明顯變化。綜上所述，我們得出