內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Reticulocalbin-1表達下調(diào)誘導(dǎo)前列腺癌細胞發(fā)生凋亡和壞死性凋亡的研究.pdf

1、研究背景
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞重要的細胞器，在蛋白質(zhì)的折疊、質(zhì)量控制、維持鈣穩(wěn)態(tài)等方面都極其重要，直接參與并影響細胞的各種生命活動。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的各種定位蛋白，如分子伴侶、酶等通過對新合成的蛋白肽鏈進行加工、折疊修飾，幫助蛋白質(zhì)形成特定的空間構(gòu)象并定向轉(zhuǎn)運。Ca2+結(jié)合蛋白、二硫鍵異構(gòu)酶等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白不僅可以發(fā)揮分子伴侶作用，還可定位于細胞胞液、細胞外，參與細胞的增殖、遷移及惡性疾病如腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　Reticulocalbi

2、n1(RCN1)具有鈣離子結(jié)合蛋白的特點，是CREC家族成員之一。人源RCN1蛋白由位于染色體11p13的RCN1基因編碼，全長331個氨基酸殘基，其結(jié)構(gòu)特點是:N端是一段信號肽，由29個氨基酸殘基組成;中間區(qū)域包含6個EF-hand結(jié)構(gòu)域;在羧基末端是一段內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留信號HDEL。
　　RCN1的定位與分布:RCN1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位蛋白，但也發(fā)現(xiàn)RCN1可定位于骨內(nèi)皮細胞、前列腺癌細胞的表面，但機制不詳;而且RCN1的C端的HDEL與

3、典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號KDEL有別，因此，RCN1也可分泌至胞外。RCN1主要分布于分泌器官，不同器官的組成細胞中RCN1的表達高低不同。
　　RCN1的功能:RCN1功能研究不多。研究顯示，鼠源RCN1基因的純合缺失可導(dǎo)致胚胎致死;另外，分泌的RCN1可作為配體，介導(dǎo)凋亡的神經(jīng)細胞被吞噬。RCN1的表達異常與疾病、特別是腫瘤的關(guān)系引起關(guān)注，RCN1在高侵襲性的乳腺癌細胞、結(jié)直腸癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞中均呈高表達。而在前列腺癌中

4、，RCN1在侵襲力較高的細胞中呈低表達。基于RCN1功能不詳，相關(guān)研究初露端倪，尚需詳盡探討。本論文首先從臨床樣本、數(shù)據(jù)庫對其表達進行分析，并通過細胞和動物實驗初步探討了RCN1在前列腺癌中的作用。
　　研究結(jié)果
　　第一部分 RCN1在前列腺癌組織中高表達
　　1.RCN1在前列腺癌組織中高表達
　　根據(jù)腫瘤基因數(shù)據(jù)庫TCGA，oncomine已有的數(shù)據(jù)分析前列腺癌中RCN1的mRNA水平高，但是生存分析卻顯示

5、高水平的mRNA與病人的生存率無顯著相關(guān)性。本論文分別收集了前列腺癌組織樣本11例，良性前列腺增生組織樣本15例，利用免疫組化檢測RCN1在癌組織和增生組織中的蛋白表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中RCN1顯著高表達。為了確定RCN1是否與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，利用免疫組化檢測周期蛋白Cyclin D1，臨床樣本檢測結(jié)果顯示，Cyclin D1不僅在前列腺癌組織中低表達，在良性增生組織中也呈現(xiàn)低表達，且與RCN1的表達無相關(guān)性。
　　

6、2.RCN1表達與細胞增殖無相關(guān)性
　　細胞水平的檢測結(jié)果顯示，RCN1的表達水平在激素非依賴、侵襲性較強的PC3細胞中RCN1的表達最低，低于RWPE1，即前列腺正常上皮細胞。前列腺癌LNCaP細胞中RCN1表達最高，DU145細胞中RCN1表達介于PC3和LNCaP細胞之間。因此，選用RCN1低表達的PC3過表達RCN1，細胞增殖結(jié)果卻顯示過表達RCN1對細胞增殖無顯著影響。因此，RCN1可能與細胞增殖無關(guān)。
　　第二部

7、分下調(diào)RCN1的表達可促進不同前列腺癌細胞凋亡或壞死性凋亡
　　DU145和LNCaP細胞RCN1表達高，我們利用流式細胞術(shù)分析降低RCN1表達對細胞周期、細胞存活的影響。
　　1.下調(diào)RCN1阻滯DU145細胞于S期
　　下調(diào)RCN1可影響細胞周期。下調(diào)DU145細胞中的RCN1，發(fā)現(xiàn)細胞周期阻滯于S期。下調(diào)LNCaP細胞中的RCN1可使周期阻滯在G2/M期。檢測S期和G2/M期關(guān)鍵調(diào)控蛋白Cyclin B在前列腺癌

8、組織和良性增生組織的表達，結(jié)果顯示，前列腺癌組織中Cyclin B顯著高表達，且與RCN1具有一定正相關(guān)性。
　　2.下調(diào)RCN1誘導(dǎo)DU145細胞凋亡
　　DU145細胞中下調(diào)RCN1可以抑制細胞活力，引起細胞死亡。下調(diào)RCN1后DU145細胞凋亡現(xiàn)象明顯，Caspase-3酶活性升高，WB結(jié)果顯示PARP剪切帶明顯。Z-VAD-FMK是Caspase抑制劑，在下調(diào)RCN1后加入，可以逆轉(zhuǎn)細胞凋亡。為了進一步驗證，將DU1

9、45細胞注入裸鼠皮下成瘤，瘤內(nèi)注射siRCN1。結(jié)果顯示，瘤內(nèi)注射siRCN1后腫瘤重量和體積顯著低于NC組。結(jié)果證明，瘤內(nèi)注射siRCN1可以下調(diào)瘤內(nèi)細胞RCN1的表達，促進腫瘤細胞凋亡。所以，下調(diào)RCN1使DU145發(fā)生細胞凋亡。
　　3.下調(diào)RCN1促進LNCaP細胞發(fā)生壞死性凋亡
　　下調(diào)RCN1可引起LNCaP細胞死亡。下調(diào)RCN1后，LNCaP細胞壞死明顯。但是，Caspase-3無明顯變化，同時其底物PARP剪

10、切無差異，Z-VAD-FMK不能逆轉(zhuǎn)下調(diào)RCN1造成的LNCaP死亡。然而，Necrostatin-1，壞死性凋亡抑制劑，可以部分逆轉(zhuǎn)LNCaP死亡。這說明下調(diào)RCN1能引起LNCaP細胞壞死性凋亡。
　　第三部分下調(diào)RCN1引起DU145和LNCaP凋亡和壞死性凋亡的機制研究
　　1.RCN1下調(diào)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與細胞凋亡和壞死性凋亡
　　(1)下調(diào)RCN1誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
　　下調(diào)RCN1可增強分子伴侶GRP7

11、8活性，同時PERK活性增強，elF2α活性降低，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生。下調(diào)RCN1可使DU145細胞CHOP被激活，誘導(dǎo)凋亡產(chǎn)生。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-PBA可逆轉(zhuǎn)下調(diào)RCN1造成的DU145和LNCaP細胞死亡，說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與了RCN1下調(diào)引起的DU145細胞凋亡和LNCaP細胞的壞死性凋亡。
　　(2) Ca2+釋放誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死性凋亡
　　下調(diào)RCN1后，CaMKⅡ被激活，說明胞液中的Ca2+增加。加入內(nèi)質(zhì)

12、網(wǎng)鈣庫釋放通道受體蛋白IP3R的抑制劑Xestospongin C，可以部分逆轉(zhuǎn)細胞死亡。而蘭尼堿受體RyR抑制劑Ryanodine對下調(diào)RCN1造成的細胞死亡卻無明顯逆轉(zhuǎn)作用。說明下調(diào)RCN1導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+通過IP3R通道釋放到胞液中，Ca2+信號通路被激活，導(dǎo)致細胞凋亡和壞死性凋亡發(fā)生。
　　2.PTEN參與下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的細胞凋亡
　　(1) PTEN參與下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的DU145細胞凋亡
　　通過前期

13、實驗數(shù)據(jù)初步推測，RCN1可能更多的參與維持細胞存活，而不是促進細胞增殖。結(jié)果證實，下調(diào)DU145細胞中的RCN1可降低AKT活性，LNCaP細胞無變化。這說明AKT通路參與了RCN1下調(diào)誘導(dǎo)的DU145細胞的凋亡。通過遺傳學(xué)背景分析，DU145是PTEN野生型前列腺癌細胞，在DU145細胞中，下調(diào)RCN1可使PTEN活性升高，AKT活性降低。而同時下調(diào)RCN1和PTEN，DU145細胞凋亡緩解，AKT活性水平升高，說明下調(diào)RCN1影響

14、細胞的存活是通過PTEN/AKT通路。
　　(2) AR和TP53可能參與下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的LNCaP細胞壞死性凋亡
　　雄激素依賴的LNCaP癌細胞，其增殖很大程度上依賴于雄激素/雄激素受體(AR)，但實驗結(jié)果證明，下調(diào)AR，RCN1略有變化，說明其可能參與介導(dǎo)RCN1下調(diào)引起的LNCaP死亡。LNCaP中TP53可以發(fā)揮正常功能，下調(diào)RCN1，TP53表達略有降低，說明AR和TP53可能參與了下調(diào)RCN1誘導(dǎo)的LNCaP

15、細胞壞死性凋亡過程。
　　結(jié)論:
　　1.前列腺癌組織中RCN1顯著高表達，但與病人生存率無相關(guān)性。周期蛋白Cyclin D1表達水平較低，與RCN1無顯著相關(guān)性。過表達RCN1對細胞增殖無顯著影響。
　　2.下調(diào)RCN1后，DU145阻滯于S期，誘導(dǎo)DU145細胞凋亡。DU145裸鼠實驗同樣表明，在體內(nèi)干擾RCN1也可以促進細胞凋亡。
　　3.下調(diào)RCN1可引起前列腺癌LNCaP細胞發(fā)生細胞壞死性凋亡。

16、　　4.下調(diào)RCN1引起的細胞凋亡和壞死性凋亡均依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及Ca2+釋放。但不同的是，下調(diào)RCN1激活了DU145細胞內(nèi)的PTEN，抑制AKT活性，細胞凋亡產(chǎn)生。而AR和TP53可能參與了下調(diào)RCN1引起的LNCaP細胞的壞死性凋亡。
　　創(chuàng)新點與不足之處
　　1.創(chuàng)新點
　　(1)首次報道內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白Reticulocalbin-1(RCN1)在前列腺癌組織中高表達，并通過腫瘤基因數(shù)據(jù)庫分析RCN1表達水平與病

17、人生存率無顯著相關(guān)性。
　　(2)首次報道RCN1可能參與調(diào)控細胞周期，但對TP53野生的LNCaP細胞作用并不顯著;且與促進細胞增殖相比，RCN1可能更多的參與維持細胞存活。
　　(3)首次報道RCN1下調(diào)可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、CaMKⅡ的活化、PTEN活化、抑制AKT活性參與DU145細胞凋亡。對TP53野生的LNCaP細胞，下調(diào)RCN1可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、CaMKⅡ的活化調(diào)控誘導(dǎo)LNCaP細胞壞死性凋亡。
　　2.不足