局麻藥布比卡因誘導(dǎo)卵巢癌和前列腺癌細胞凋亡及其機制研究.pdf

1、第一部分布比卡因?qū)δ[瘤細胞活性及耐藥性的影響
　　目的：明確布比卡因是否有抑制腫瘤細胞活性的作用，并觀察布比卡因處理后是否能增加腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性。驗證布比卡因的促腫瘤細胞凋亡作用是否通過調(diào)控凋亡蛋白酶的活性。
　　方法：體外培養(yǎng)人卵巢癌細胞（SKOV-3）、前列腺癌細胞（PC-3）和正常腎小管上皮細胞（HK-2），實驗前將腫瘤細胞種植在24孔細胞培養(yǎng)板中，24小時后細胞達到70％-80%融合度時開始試驗。實驗組腫

2、瘤細胞培養(yǎng)基中加入不同容積布比卡因以達到1μM、10μM、100μM、1 mM四種不同的終濃度，對照組加入相等容積的生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)24h或72小時后用MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）比色法檢測腫瘤細胞的活性。為比較布比卡因?qū)δ[瘤細胞和正常細胞作用的差異性，將正常的人腎小管上皮細胞（HK-2）與1mM布比卡因共同培養(yǎng)24小時后，用MTT比

3、色法測定細胞的活性。在觀察布比卡因與抗腫瘤藥物共同作用的實驗組中，加入100μM、1mM布比卡因的同時給予治療濃度的抗腫瘤藥物紫杉醇（taxol），共同培養(yǎng)24小時后同樣以MTT比色法測定腫瘤細胞的活性。凋亡蛋白酶檢測組加入1mM布比卡因，24小時后免疫熒光染色法測定細胞中活性凋亡蛋白酶caspase3、caspase8和caspase9的表達量。之后使用相應(yīng)蛋白酶抑制劑和FAS配體中和抗體處理，觀察凋亡相關(guān)蛋白酶和細胞膜表明死亡受體在

4、布比卡因誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡中的作用。
　　結(jié)果：MTT法檢測細胞活性的結(jié)果顯示，只有最高實驗濃度（1mM）的布比卡因在24和72小時的培養(yǎng)后均顯著抑制了SKOV-3和PC-3腫瘤細胞的活性。100μM組腫瘤細胞活性雖可見輕微下降，但未及顯著性差異。SKOV-3和PC-3腫瘤細胞在1mM布比卡因存在下培養(yǎng)72小時后細胞活性下降的程度明顯大于24小時，表明布比卡因?qū)δ[瘤細胞活性的抑制隨時間的延續(xù)逐步增加。SKOV-3細胞活性下降的程度

5、較PC-3更大，體現(xiàn)局麻藥布比卡因?qū)Σ煌┘毎牟町愋詺饔?。HK-2細胞在1mM布比卡因處理24小時的情況下細胞活性輕微下降，而無顯著性差異，說明了局麻藥有效的殺傷作用更多的體現(xiàn)在腫瘤細胞上，提示我們其可能干擾的是腫瘤細胞特異的生存條件。將100μM、1mM布比卡因與紫杉醇混合培養(yǎng)腫瘤細胞時，表現(xiàn)出的是布比卡因與抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的疊加殺傷效應(yīng)，而非協(xié)同效應(yīng)。
　　免疫熒光分析顯示，1mM布比卡因處理24h后，SKOV-3細

6、胞中活性caspase3,8和9的表達均明顯上升，Caspase8和9抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了SKOV-3的凋亡。PC-3細胞中只有活性caspase3和9的表達上調(diào)，而caspase8未見改變，同時只有caspase9抑制劑部分逆轉(zhuǎn)了布比卡因誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，caspase8抑制劑無效。最后，F(xiàn)AS配體中和抗體處理后并未改變布比卡因引起的腫瘤細胞凋亡。
　　結(jié)論：布比卡因能夠顯著抑制腫瘤細胞活性，且具有劑量和時間依賴性。其誘導(dǎo)腫瘤細胞

7、凋亡的作用與凋亡蛋白酶的激活有關(guān)，與細胞膜表明死亡受體無關(guān)。
　　第二部分布比卡因?qū)δ[瘤細胞增殖與遷移能力的影響
　　目的：明確布比卡因是否有抑制腫瘤細胞增殖和遷移力的作用。
　　方法：體外培養(yǎng)卵巢癌（SKOV-3）和前列腺癌（PC-3）細胞，增殖實驗前將腫瘤細胞種植在置有玻片的24孔板上，在24孔板中培養(yǎng)24小時后細胞達到70%-80%融合度時開始試驗。細胞增殖實驗中腫瘤細胞SKOV-3和PC-3的培養(yǎng)基中加入1mM

8、布比卡因后培養(yǎng)24h，之后免疫熒光染色法測定細胞增殖重要標記物ki67蛋白的表達量。腫瘤細胞遷移實驗中使用劃痕實驗。遷移實驗前將腫瘤細胞終于細胞培養(yǎng)皿中，24小時后當(dāng)其鋪滿皿底形成單細胞層后開始實驗。用一毫升槍頭尖端在皿底做“十”字形劃痕并在皿底座標記，以保證位置固定，顯微鏡下拍照記錄劃痕造成的間隙形態(tài)。之后腫瘤細胞培養(yǎng)液中加入濃度1mM的布比卡因，培養(yǎng)24小時后再次顯微鏡下拍照記錄劃痕形態(tài)，用Image-Pro Plus軟件比對前后缺

9、損面積的變化，根據(jù)公式（初始缺損面積-最終缺損面積）/初始缺損面積，計算出創(chuàng)傷愈合率，由此估算細胞整體遷移率。結(jié)果：熒光強度分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中加入1mM布比卡因培養(yǎng)24小時后，SKOV-3和PC-3細胞中Ki67的表達均顯著下降，表明1mM布比卡因有效抑制了這兩種腫瘤細胞的增殖能力。細胞遷移實驗中，SKOV-3和PC-3在1mM布比卡因的影響下，較對照組的創(chuàng)傷愈合率顯著下降，表明其細胞遷移能力因布比卡因的存在而下降。
　　結(jié)論

10、：布比卡因能有效抑制SKOV-3和PC-3腫瘤細胞的增殖能力和遷移率。
　　第三部分 GSK-3β在布比卡因誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡中的影響
　　目的：探索GSK-3β的活性對布比卡因誘導(dǎo)的SKOV-3和PC-3腫瘤細胞凋亡有何種影響。方法：體外培養(yǎng)卵巢癌（SKOV-3）和前列腺癌（PC-3）細胞，實驗前將腫瘤細胞種植
　　玻片上，在24孔板中培養(yǎng)24小時后細胞達到70%-80%融合度時開始試驗。在1mM布比卡因處理24小時

11、后，免疫熒光法測定磷酸化的總 GSK-3β、活化型 GSK-3β（GSK-3βtyr216）以及抑制型GSK-3β（GSK-3βser9）的量。其它實驗在1mM布比卡因加入培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，用GSK-3抑制劑SB-216763抑制其活性，觀察腫瘤細胞存活情況。再應(yīng)用基因沉默技術(shù)用siRNA sc-35527沉默GSK-3β基因，在此基礎(chǔ)上加入1mM布比卡因，培養(yǎng)24小時后用免疫熒光技術(shù)觀察凋亡相關(guān)蛋白酶 Caspase3，Caspase8

12、,Caspase9的表達情況，以及最終腫瘤細胞的生存情況。
　　結(jié)果：實驗結(jié)果顯示1mM布比卡因作用24小時后，SKOV-3磷酸化的總 GSK-3β、GSK-3βtyr216和GSK-3βser9均有顯著增加，其中代表GSK-3β活性的磷酸化GSK-3βtyr216升高最為明顯，有將近一倍的提升。而 PC-3中磷酸化的總 GSK-3β、GSK-3βtyr216和GSK-3βser9均無顯著改變。抑制劑和SiRNA的運用都部分減輕了

13、布比卡因誘導(dǎo)的SKOV-3細胞凋亡，但這些作用并未在PC-3細胞上發(fā)現(xiàn)。在沉默GSK-3β基因后，我們發(fā)現(xiàn) GSK-3β僅有微弱表達，免疫熒光分析顯示，凋亡相關(guān)蛋白酶 Caspase3，Caspase8,Caspase9的表達隨著GSK-3β基因的沉默也顯著下降。
　　結(jié)論：1mM布比卡因的處理增加了 SKOV-3磷酸化的總 GSK-3β、GSK-3βtyr216和GSK-3βser9，其中活化型GSK-3β升高最為顯著。但是對P