重組蛋白MAP30誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡及其凋亡機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：MAP30是一種核糖體失活蛋白，它能誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，但其凋亡機(jī)制尚未十分清楚。本文通過克隆苦瓜蛋白MAP30基因，原核表達(dá)并純化MAP30融合蛋白；體外實(shí)驗(yàn)探討MAP30誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞的凋亡及其凋亡機(jī)制。
　　 方法：
　　 (1)應(yīng)用PCR技術(shù)從苦瓜基因組中擴(kuò)增出MAP30基因片段，將其TA克隆和測(cè)序，并構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-MAP30，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG

2、誘導(dǎo)，用NTA-Ni2+樹脂分離純化所表達(dá)的MAP30融合蛋白，純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定。
　　 (2)重組MAP30融合蛋白與人胃癌細(xì)胞BGC823共培養(yǎng)，運(yùn)用顯微鏡觀察其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，通過MTT檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，通過流式細(xì)胞術(shù)來分析其誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞凋亡的作用。
　　 (3)通過化學(xué)發(fā)光、免疫組化、RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)重組MAP30融合蛋白對(duì)BGC-823細(xì)胞的線粒體膜電位、casp

3、ase-9和Apaf-1mRNA表達(dá)、caspase-3和caspase-12活性、NF-κB表達(dá)的影響，初步探討MAP30誘導(dǎo)BGC-823細(xì)胞的凋亡機(jī)制。
　　 結(jié)果：(1)成功擴(kuò)增出MAP30基因?yàn)?61bp，與GenBank中公布的DQ643967的同源性為100％，與DQ643968和S79450的同源性為99％。
　　 (2)成功構(gòu)建pET-28a-MAP30重組原核表達(dá)質(zhì)粒。獲得了重組MAP30融合蛋白，其

4、大小約為30KDa，與預(yù)測(cè)一致。
　　 (3)不同濃度MAP30融合蛋白作用于BGC-823細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化；細(xì)胞增殖的速度隨MAP30蛋白濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸減慢；細(xì)胞的亞二倍體峰逐漸升高；細(xì)胞的線粒體膜電位降低；細(xì)胞的caspase-9、Apaf-1 mRNA表達(dá)和caspase-3活性增強(qiáng)，但細(xì)胞的caspase-12含量無明顯變化。
　　 (4)MAP30蛋白能活化細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ