白藜蘆醇對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因PDCD5表達(dá)影響的研究.pdf

1、背景和目的:胃癌是消化系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,目前胃癌已成為中國(guó)內(nèi)地第三大常見腫瘤,嚴(yán)重威脅人民的健康和生命,是我國(guó)重點(diǎn)研究的惡性腫瘤之一。人程序化死亡分子5(the human programmed cell death5,PDCD5)基因是由北京大學(xué)人類疾病基因研究中心1999年在國(guó)際上首先報(bào)道的一個(gè)人類新基因,是從人白血病細(xì)胞株TF-1細(xì)胞中克隆到的凋亡相關(guān)新基因(GeneBank登記號(hào)AF014955)。PDCD5定位于19

2、q12-q13.1,參與細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控。PDCD5的mRNA在50余種人類組織中均有表達(dá),并不限定于造血系統(tǒng),其中在成年心、睪丸、腎、腎上腺及胎盤中高表達(dá),其中胚胎組織表達(dá)明顯低于成年組織,國(guó)內(nèi)外已有多家實(shí)驗(yàn)室利用不同技術(shù)發(fā)現(xiàn)PDCD5在疾病情況下,特別是在腫瘤、自身免疫性疾病和局部損傷的情況下表達(dá)明顯下降。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等藥用植物中的一種多酚類化合物,作為低毒的天然藥物,對(duì)消

3、化、呼吸、血液、生殖等多個(gè)系統(tǒng)來源的腫瘤細(xì)胞有抑制作用,可顯著抑制多種人類腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明它可以通過抗氧化、抑制環(huán)氧化酶(COX)、抑制細(xì)胞色素P450酶、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等來發(fā)揮抗癌作用。
　　為探討白藜蘆醇對(duì)人胃低分化腺癌BGC-823細(xì)胞中PDCD5蛋白和mRNA表達(dá)的影響以及白藜蘆醇對(duì)BGC-823細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,本研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)PDCD5在BGC-823細(xì)胞

4、中的蛋白表達(dá);采用原位雜交技術(shù)檢測(cè)BGC-823細(xì)胞中PDCD5在mRNA水平上的表達(dá);采用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法檢測(cè)BGC-823細(xì)胞的增殖與凋亡。探討PDCD5在BGC-823細(xì)胞中的表達(dá)與BGC-823細(xì)胞凋亡的相關(guān)性,為胃癌的臨床治療提供理論依據(jù)。
　　材料和方法:1.標(biāo)本:人胃低分化腺癌細(xì)胞BGC-823購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所,經(jīng)復(fù)蘇孵育,傳代分為不同的實(shí)驗(yàn)組,分別用25μmol/L、50μmol/L、100μ

5、mol/L、200μmol/L的白藜蘆醇處理BGC-823細(xì)胞24h、48h、72h。并設(shè)空白對(duì)照組(培養(yǎng)液對(duì)照組),溶劑對(duì)照組(DMSO對(duì)照組),順鉑組(3μg/ml),聯(lián)合用藥組(白藜蘆醇200μmol/L+順鉑3μg/ml)。2.應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞中PDCD5蛋白表達(dá)。3.應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)各組BGC-823細(xì)胞中PDCD5 mRNA表達(dá)。4.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組分別作用24h、48h、72h細(xì)

6、胞的增殖分化情況。5.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組分別作用24h、48h、72h細(xì)胞的凋亡情況。6.應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)各組作用24h細(xì)胞凋亡的情況。7.采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,兩組均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)(t-test);兩組以上均數(shù)的比較用方差分析(ANVOA);以α=0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果:1.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果:PDCD5蛋白在人胃低分化腺癌BGC-823細(xì)胞中低表達(dá);以

7、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L4種不同濃度的白藜蘆醇作用于BGC-823細(xì)胞24h、48h、72h后PDCD5蛋白表達(dá)均較空白對(duì)照組有所升高;3個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨著濃度增加,PDCD5蛋白表達(dá)增高,且呈濃度依賴性,50-200μmol/L白藜蘆醇組與空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨著時(shí)間延長(zhǎng),PDCD

8、5蛋白表達(dá)升高,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);25μmol幾白藜蘆醇組、溶劑對(duì)照組與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3個(gè)時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組及順鉑組與聯(lián)合組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),聯(lián)合組中PDCD5蛋白的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,以作用72h升高最顯著,三個(gè)時(shí)間段相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2.原位雜交結(jié)果:PDCD5 mRNA在人胃低分化腺癌BGC-823細(xì)胞中低表達(dá);以25μmol/L、50

9、μmol/L、100μmol/L、200μmol/L4種不同濃度的白藜蘆醇作用于BGC-823細(xì)胞24h、48h、72h后PDCD5 mRNA表達(dá)均較空白對(duì)照組有所升高;3個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨著濃度增加,PDCD5 mRNA表達(dá)增高,白藜蘆醇濃度在50μmol/L以上實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨著時(shí)間延長(zhǎng),PDCD5mRNA表達(dá)升高,

10、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);25μmol/L白藜蘆醇組、溶劑對(duì)照組與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3個(gè)時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組及順鉑組與聯(lián)合組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),聯(lián)合組中PDCD5 mRNA的表達(dá)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高,以作用72h升高最顯著,三個(gè)時(shí)間段相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖分化結(jié)果:BGC-823細(xì)胞在經(jīng)25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L

11、、200μmol/L的白藜蘆醇處理24h、48h、72h后,G1期及G2期比例均較空白對(duì)照組有所下降,S期比例較空白對(duì)照組有所升高;3個(gè)時(shí)間段內(nèi)隨著濃度的升高,G1期、G2期比例逐漸下降,S期比例逐漸升高,50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L白藜蘆醇組與空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組相比,G1期、G2期比例的下降和S期比例的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比,S期比例的升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同

12、一濃度的白藜蘆醇作用后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)G1期、G2期比例逐漸下降,S期比例逐漸升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);25μmol/L白藜蘆醇組、溶劑對(duì)照組與空白組相比周期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3個(gè)時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組及順鉑組與聯(lián)合組相比,周期比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果:空白組BGC-823細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)是活細(xì)胞;在同一時(shí)間段的各個(gè)樣品中,隨著白藜蘆醇濃度的增加,細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡

13、及壞死率逐漸升高,且早期凋亡率升高顯著,白藜蘆醇濃度在50μmol/L以上的實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比,細(xì)胞早期凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):同一濃度的白藜蘆醇作用后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡及壞死率逐漸升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);25μmol/L白藜蘆醇組、溶劑對(duì)照組與空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3個(gè)時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組及順鉑組

14、與聯(lián)合組相比,細(xì)胞早期凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),晚期凋亡及壞死率差異不顯著(P>0.05)。5.TUNEL結(jié)果:用TUNEL方法檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色,染色質(zhì)分布不均,染色深淺不一。空白對(duì)照組中幾乎未見到凋亡細(xì)胞,而實(shí)驗(yàn)組中的凋亡細(xì)胞數(shù)隨白藜蘆醇濃度的增加明顯增加,白藜蘆醇濃度50μmol/L以上實(shí)驗(yàn)組,順鉑組及聯(lián)合用藥組與空白對(duì)照組及溶劑對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各實(shí)驗(yàn)組之間兩兩相比,差異有

15、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);200μmol/L白藜蘆醇組與順鉑組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其他白藜蘆醇組與順鉑組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);實(shí)驗(yàn)組及順鉑組與聯(lián)合組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.白藜蘆醇能以劑量依賴的方式上調(diào)BGC-823細(xì)胞中PDCD5的蛋白及mRNA表達(dá)并使BGC-823細(xì)胞阻滯在S期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。2.白藜蘆醇誘導(dǎo)后BGC-823細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡等一系列形態(tài)學(xué)