MACC1基因?qū)ξ赴┘毎闎GC-823基因表達的影響.pdf

1、研究背景:
　　 胃癌是消化系統(tǒng)常見腫瘤，在世界范圍，胃癌死亡率居世界第二位，雖然在發(fā)達國家，近年胃癌發(fā)病率有所下降，但在我國，根據(jù)最新的統(tǒng)計資料，我國城市胃癌的死亡率居惡性腫瘤死亡率的第三位，在農(nóng)村，胃癌的死亡率甚至居于第一位。外科手術(shù)仍是其主要的治療方法，但僅有30-50％的患者可獲得根治性切除，雖然目前針對胃癌的藥物及治療方法較多，但療效并不滿意，究其原因，胃癌的早期轉(zhuǎn)移是死亡率高的重要原因，故而研究胃癌早期轉(zhuǎn)移的機制及其

2、標志物就顯得尤為重要了。
　　 2009年stein等人報道了MACC1(Metastasis-associated in colon cancer1)基因在腸癌中的可能作用，他們研究發(fā)現(xiàn)MACC1的表達水平與生存率明顯相關(guān)，低表達的患者5年生存率為80％，而高表達者其5年生存率僅有15％。發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的MACC1mRNA水平明顯高于未轉(zhuǎn)移患者(p＜0.0001)，Logistic和Cox回歸分析表明，MACC1可以作為腸癌轉(zhuǎn)

3、移的預后指標。繼而出現(xiàn)大量的研究報道MACC1不僅在腸癌,而且與肝細胞癌、肺癌、胃癌等實體腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)。其中，有學者發(fā)現(xiàn)在MACC1基因在發(fā)生血管轉(zhuǎn)移的肝細胞癌中高表達，Shimokawa H等人收集了146例Ⅰ期肺腺癌術(shù)后標本，發(fā)現(xiàn)MACC1的表達水平與預后密切相關(guān)。而在胃癌中，目前有文獻報道MACC1基因的表達與其腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)。這些均表明MACC1在早期發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移及復發(fā)方面具有重要的指導作用，極有可能作為一個腫瘤預后的分子標志物

4、。但是在胃癌方面的作用仍不深入，需進一步的探討研究。
　　 研究MACC1基因功能，需要大量的體內(nèi)體外實驗，所以構(gòu)建合適的MACC1表達載體是研究其結(jié)構(gòu)功能的必要基礎(chǔ)。目前國內(nèi)尚未見構(gòu)建胃癌MACC1表達載體的相關(guān)報道。本研究應用293FT細胞為模板，成功擴增出MACC1全長cDNA序列及MACC1表達的干擾片段，構(gòu)建過表達載體及干擾表達載體，為研究該基因在多種類型腫瘤中的作用及機制奠定了基礎(chǔ)。已有文獻報道，胃癌中MACC1基因

5、與其腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)，為了進一步研究其作用機制，我們首次成功建立了穩(wěn)定表達MACC1的胃癌pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株及其MACC1基因沉默表達的細胞株sh-MACC1/BGC-823，并對MACC1的表達情況通過RT-PCR及Western blot進行驗證分析，為探討MACC1在胃癌中的作用機制提供了可靠保證。
　　 基因芯片又稱DNA微陣列（DNA microarray），該技術(shù)是指將大量探針分子固定于支持物上

6、，將樣品分子標記，然后將兩者進行雜交，利用相關(guān)軟件收集雜交信號，從而獲取樣品分子的數(shù)量和基因信息。通過不同的探針序列的設計、不同的分析方法使得該技術(shù)的應用價值也各有不同，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。
　　 隨著20世紀80年代人類基因組計劃的開展，結(jié)構(gòu)基因組學已經(jīng)得到了充分的認識，而功能基因組學方面仍存在太多的未知領(lǐng)域，基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)給功能基因組的研究提供了一個全新的平臺?；虮磉_譜芯

7、片目前應用比較廣泛，技術(shù)比較成熟，它可以檢測整個基因組的各個基因mRNA的變化水平。傳統(tǒng)的研究方法僅僅局限于某個或某幾個基因和他們之間簡單的調(diào)控關(guān)系，無法全面的認識和研究腫瘤整個發(fā)生過程中基因復雜的調(diào)控關(guān)系。而基因芯片恰恰能解決傳統(tǒng)研究方法的不足之處，其以大規(guī)模高通量的方法研究成千上萬的基因在不同狀態(tài)下的表達，預測他們的功能，預測他們之間的復雜的相互調(diào)控關(guān)系。從基因水平研究腫瘤相關(guān)基因的變化，通過基因芯片技術(shù)篩選和檢測腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)

8、移過程中的差異表達基因，不但可以從病理狀態(tài)中尋找可能病因，也為早期的診斷及預后提供依據(jù)，基因芯片技術(shù)和臨床的相互結(jié)合將為成為未來研究發(fā)展的一個必然趨勢。胃癌的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移是多種因素的相互之間的作用、多個基因表達異常的結(jié)果，其具體分子機制至今仍未能闡明。這就需要基因芯片技術(shù)幫助我們對其進一步的研究。
　　 本研究中我們通過基因轉(zhuǎn)載技術(shù)，構(gòu)建了MACC1過表達（pBaBb-MACC1/BGC-823）及沉默（sh-MACC1/BGC

9、-823）紐胞株，然后利用基因芯片技術(shù)對這兩個細胞株進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)MACC1的改變引起細胞株基因的廣泛改變，其中LHX9、PDK3及PLEKHA5與MACC1的表達趨勢完全一致，IL8、MYO1A及OST-β則與MACC1的表達趨勢完全相反，進而通過文獻查閱，希望找到與MACC1相互調(diào)控的關(guān)系或與胃癌早期轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為下一步的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.通過基因轉(zhuǎn)載技術(shù)建立穩(wěn)定過表達MACC1基因

10、的胃癌細胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及穩(wěn)定抑制其表達的細胞株sh-MACC1/BGC-823;
　　 2.利用基因芯片研究 MACC1表達改變的細胞株pBaBb-MACC1/BGC-823, sh-MACC1/BGC-823及正常細胞株BGC-823之間的基因表達譜差異;
　　 3.尋找與MACC1表達趨勢一致及相反的差異表達基因，探討MACC1與差異表達基因之間可能存在的細胞信號通路或各方面調(diào)節(jié)機制的聯(lián)系

11、。
　　 方法:
　　 1.以人胚腎293FT細胞為模板，經(jīng)PCR擴增獲全長MACC1 cDNA序列，將目的基因序列及干擾目的基因的片段序列克隆入pBaBb-puro及pSUPERretro-puro表達載體，建立pBaBb-puro-MACC1過表達載體和pSUPERretro-puro-MACC1抑制MACC1基因表達的載體。經(jīng)過酶切鑒定、測序并觀察轉(zhuǎn)染293FT細胞報告基因表達情況從而判斷是否構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的兩

12、個載體分別轉(zhuǎn)染入人胃痛BGC-823細胞，感染結(jié)束后48h加入puromycin（0.5μg/ml）篩選陽性克隆，然后在培養(yǎng)瓶中擴增培養(yǎng)并傳代建系。收集細胞的RNA，進行熒光定量PCR及Western blot檢測MACC1在這些細胞中表達情況，并采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組之間差異以鑒定穩(wěn)定細胞株。
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13、imbleGen表達譜芯片對MACC1基因轉(zhuǎn)染前后的胃癌細胞株BGC-823的基因進行研究，該芯片包括45033個基因。分別提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用NimbleGen進行標記，進而用NimbleGen雜交系統(tǒng)進行雜交和NimbleGen緩沖液試劑盒洗滌，芯片結(jié)果采用Axon Genepox4000B掃描儀進行掃描，通過NimbleScan軟件讀取數(shù)據(jù)，進行標準化等分析后輸入Agilent GeneSpringGX軟件進一步

14、分析。差異基因的篩選標準為ratio≥2，為避免實驗誤差，每個細胞株各重復3次。
　　 3.通過分析找出在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調(diào)、sh-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調(diào)及在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調(diào)、sh-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調(diào)的基因，利用qRT-PCR進行驗證，并采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，通過單因素方差分析(one-wayAN

15、OVA)比較各組之間差異篩選出相關(guān)基因。通過文獻的查閱，試圖尋找與MACC1的相關(guān)性，為胃癌的早期轉(zhuǎn)移研究提供依據(jù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功擴增全長的MACC1cDNA及干擾片段，經(jīng)測序鑒定完全正確;轉(zhuǎn)染293FT細胞可見清晰的綠色熒光表達，順利構(gòu)建了MACC1過表達及沉默的穩(wěn)定細胞株，通過qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)pBaBb-MACC1/BGC-823、sh-MACC1/BGC-823穩(wěn)定細

16、胞株構(gòu)建成功。
　　 2.對過表達、沉默及正常的胃癌細胞株BGC-823進行基因表達譜分析后發(fā)現(xiàn)表達上調(diào)及下調(diào)基因多達數(shù)千種，這些差異表達基因的功能涉及多個方面，包括與細胞凋亡及周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生進展相關(guān)、酶活性基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄及翻譯活性調(diào)控等多個方面，找出在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調(diào)、sh-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調(diào)及在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調(diào)、s

17、h-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調(diào)的基因LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β六個基因，并對其進行qRT-PCR驗證并和統(tǒng)計學分析，與基因芯片結(jié)果一致。
　　 3.查閱文獻資料，對LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β基因進行結(jié)構(gòu)、功能等方面的研究分析，找出可能與MACC1的相關(guān)性或與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為胃癌早期轉(zhuǎn)移的進一步研究提供方向。
　　 結(jié)論

18、:
　　 1.我們成功建立了MACC1基因轉(zhuǎn)染及抑制其表達的細胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823，通過驗證表明其穩(wěn)定表達，統(tǒng)計學分析具有顯著性差異。
　　 2.應用基因芯片技術(shù)對3個細胞株差異基因進行篩選，發(fā)現(xiàn)MACC1基因的改變引起pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823細胞株廣泛的基因改變，找出與MACC1表達趨勢一致及相反的6個基因，并對這些

19、基因進行qRT-PCR驗證，結(jié)果提示與基因芯片結(jié)果一致。
　　 3.MACC1基因轉(zhuǎn)染胃癌細胞株BGC-823后引起的胃癌細胞基因表達譜廣泛改變，這些基因的功能涉及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、細胞周期調(diào)控、蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯、信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄等多個方面。
　　 4.對差異基因的分析發(fā)現(xiàn)MACC1基因引起胃癌細胞基因表達譜中一些非常重要的信號轉(zhuǎn)導通路上分子的改變，其中與MACC1表達趨勢完全一致和相反的基因可能與胃癌的發(fā)展轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，但是與M