MACC1基因在肺癌組織及肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：MACC1（metastasis-associatedincoloncancerl，MACC1）基因是2009年發(fā)現(xiàn)的與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)的新基因。研究顯示，MACC1基因作為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF/MET信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子在結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用，而且與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。MACC1可以與MET啟動(dòng)子結(jié)合，上調(diào)結(jié)腸癌中MET的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和增殖；MACC1基因在HGF誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲中亦發(fā)揮重要作

2、用。作為一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的基因，目前為止，MACC1表達(dá)水平與肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系尚不明確。因此，我們擬通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和Westernblot分別檢測(cè)肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中MACC1的表達(dá)。我們前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MACC1在肺癌細(xì)胞株SBC-5中高表達(dá)。因此擬通過(guò)構(gòu)建MACC1基因特異性的真核表達(dá)干涉載體，轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系SBC-5，篩選出MACC1基因表達(dá)下調(diào)明顯的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。進(jìn)而檢測(cè)MACC1表達(dá)下調(diào)對(duì)肺癌細(xì)胞系SBC-5體外

3、增殖活性、細(xì)胞遷移的影響，從而為MACC1分子成為肺癌治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)性研究基礎(chǔ)。
　　方法：（1）采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)63例肺組織（包括正常肺組織和肺腺癌組織）中MACC1蛋白的表達(dá)情況；Westernblot法檢測(cè)4種肺癌細(xì)胞系中MACC1蛋白表達(dá)。（2）設(shè)計(jì)并化學(xué)合成兩對(duì)MACC1（metastasis-associatedincoloncancerl，MACC1）基因特異的發(fā)夾結(jié)構(gòu)小RNA，并且在BLAST中對(duì)靶序列

4、進(jìn)行同源性分析，退火后連接到pSilencer4.1-CMVneo載體中，構(gòu)建MACC1基因特異性真核表達(dá)干涉載體。通過(guò)限制性酶切及測(cè)序方法鑒定重組載體。將MACC1基因特異的干涉表達(dá)載體及無(wú)關(guān)干涉載體分別命名為MACC1/shRNA-1、MACC1/shRNA-2、MACC1/shRNA-NC。（3）分別將MACC1基因特異性的干涉表達(dá)載體及無(wú)關(guān)干涉對(duì)照載體經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系SBC-5細(xì)

5、胞，經(jīng)G418篩選兩周后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。（4）通過(guò)RT-PCR和Westernblot法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SBC-5細(xì)胞中MACC1mRNA和蛋白表達(dá)情況。（5）MTT法和克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染干涉載體組SBC-5細(xì)胞體外生長(zhǎng)增殖狀況；劃痕試驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染干涉載體組SBC-5細(xì)胞遷移能力的變化。
　　結(jié)果：（1）免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，肺腺癌組織中MACC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為38.3％；MACC1蛋白在肺癌SBC-5細(xì)胞系中高表達(dá)，而在肺癌

6、A549、PC14、SBC-3中幾乎檢測(cè)不到表達(dá)。（2）限制性酶切和測(cè)序方法鑒定結(jié)果證實(shí)，針對(duì)MACC1基因的真核表達(dá)干涉載體構(gòu)建成功。（3）分別將MACC1/shRNA-1、MACC1/shRNA-2、MACC1/shRNA-NC經(jīng)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系SBC-5，經(jīng)G418篩選兩周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分別命名為SBC-5-S1、SBC-5-S2、SBC-5-NC。（4）同轉(zhuǎn)染MACC1/sh

7、RNA-NC及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MACC1/shRNA-1的SBC-5-S1細(xì)胞中MACC1mRNA和蛋白表達(dá)水平分別抑制了約68.5％和58.5％，而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MACC1/shRNA-2的SBC-5-S2細(xì)胞中則沒(méi)有明顯變化，故選擇SBC-5-S1細(xì)胞用于下一步試驗(yàn)。（5）MTT和克隆形成試驗(yàn)結(jié)果顯示，SBC-5-S1細(xì)胞的增殖活性明顯降低（P<0.05）；劃痕試驗(yàn)觀察到SBC-5-S1細(xì)胞的增殖、遷移能力明顯減弱。