RIP3誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的主動(dòng)性的細(xì)胞死亡過程，它對(duì)于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是至關(guān)重要的。RIP3是 RIP 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員之一，它具有自磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和激活NF-κB的作用。此外，RIP3還能通過其 C 端獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域與 RIP 結(jié)合并募集到TNFR1 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物中。但到目前為止，關(guān)于 RIP3 的細(xì)胞定位以及促凋亡的分子機(jī)制仍不清楚。 前人的研究已經(jīng)表明：RIP3 的 N 端的激酶結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄浼っ富钚?/p>

2、和自磷酸化是必需的，而 C 端的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄浯俚蛲龌钚院图せ?NF-κB 的功能是非常關(guān)鍵的。為了研究其促凋亡的具體機(jī)制，本文將 RIP3 的 C 端作為研究的重點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)一個(gè)僅包含 RIP3 的C端從 224 位到 518 位氨基酸的缺失突變體，RIP3△N223 (tRIP3)，就可以在人肝癌細(xì)胞系 QGY-7703 中誘導(dǎo)顯著的細(xì)胞凋亡。FADD是死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路中的關(guān)鍵成員，F(xiàn)ADD的顯性負(fù)性突變體 (FAD

3、D-DN)可以在多種細(xì)胞系中阻斷 TNF-α，F(xiàn)asL，或 TRAIL 激活的死亡受體通路。為了探討FADD與RIP3在 TNFR1 信號(hào)通路中的相互關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn) FADD-DN 能明顯阻止tRIP3誘導(dǎo)的凋亡；然而RIP3的顯性負(fù)性突變體 (RIP3-DN) 卻不能阻止 FADD 誘導(dǎo)的凋亡。因此我們推斷在 TNFR1 介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路中，tRIP3 可能在 FADD的上游發(fā)揮作用。意外的是：FADD-DN 不能阻止 RIP3 誘

4、導(dǎo)的凋亡。這種差別暗示全長(zhǎng)的 RIP3 與 tRIP3 可能通過不同的通路誘導(dǎo)凋亡。 考慮到已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道 RIP 家族的 RIP 和 RIP4 會(huì)在死亡受體誘導(dǎo)的凋亡途徑中被半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶 caspase 剪切，設(shè)想RIP3也會(huì)有類似的情況。與預(yù)期一致，發(fā)現(xiàn)在人宮頸癌細(xì)胞系 HeLa 中，RIP3分子會(huì)在凋亡刺激下被 Caspase-8 于天冬氨酸 D328 位后剪切，這個(gè)剪切過程可以被廣譜的caspase 抑制

5、劑 Z-VAD-FMK 完全抑制，而不能被 Caspase-8 特異性的抑制劑Z-IETD-FMK 所抑制，提示 RIP3 還可能被其它的分子剪切。全長(zhǎng)的 RIP3 可以同時(shí)誘導(dǎo) caspase 依賴和非依賴的細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以激活 NF-κB。剪切后產(chǎn)生的兩個(gè)片段分別包含完整的激酶結(jié)構(gòu)域 (N 端片斷，RIP3-N，aa 1-328) 和主要的獨(dú)特結(jié)構(gòu)域。全長(zhǎng) RIP3 主要在胞質(zhì)中彌散分布；RIP3-N 在整個(gè)細(xì)胞中都均勻分布；R

6、IP3-C 在低表達(dá)的情況下保留了 RIP3的定位方式，但高表達(dá)時(shí)可在細(xì)胞質(zhì)中形成點(diǎn)狀或絲狀的結(jié)構(gòu)。RIP3-N 喪失了全長(zhǎng) RIP3 的一些生理活性，如促凋亡和激活 NF-κB：RIP3-C 保留了這兩種功能但有所改變。RIP3-C 只能誘導(dǎo) caspase 依賴的細(xì)胞凋亡，而且 RIP3-C 比 RIP3誘導(dǎo) NF-κB 激活的能力強(qiáng)得多。值得注意的是，外源的 RIP3 是一個(gè)不穩(wěn)定的蛋白，它的兩個(gè)剪切片斷比全長(zhǎng) RIP3 的穩(wěn)定性

7、強(qiáng)，暗示了 RIP3 的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄洳环€(wěn)定性都有貢獻(xiàn)。我們還觀察了 RIP3 的點(diǎn)突變對(duì)其功能的影響。RIP3 不被剪切的突變體，RIP3(D328A)，表現(xiàn)出與野生型 RIP3 相似的細(xì)胞定位和促凋亡能力。RIP3 的賴氨酸 K50 位對(duì)于它的激酶活性和 ATP 結(jié)合都很關(guān)鍵，在 RIP 家族中十分保守。RIP3(K50A)，一個(gè)失去激酶活性的點(diǎn)突變體，與去掉激酶結(jié)構(gòu)域的 RIP3-C一樣，只能誘導(dǎo) caspase 依賴的細(xì)胞凋亡

8、，這暗示了 RIP3 的激酶活性對(duì)于其誘導(dǎo)的caspase 非依賴的凋亡是必需的。本實(shí)驗(yàn)室以前的工作闡明了 RIP3 是一個(gè)核質(zhì)穿梭蛋白，我們發(fā)現(xiàn)RIP3(D328A)也可以進(jìn)行核質(zhì)穿梭。有趣的是，RIP3(K50A)與RIP3-N 都喪失了核質(zhì)穿梭能力。RIP3-C 在胞質(zhì)彌散分布時(shí)可以核質(zhì)穿梭，然而一旦形成了點(diǎn)狀或絲狀結(jié)構(gòu)則不能進(jìn)行核質(zhì)穿梭。這些結(jié)果表明 RIP3 的核質(zhì)穿梭與其誘導(dǎo) caspase 非依賴的凋亡能力是密切相關(guān)的。我