腫瘤壞死因子α誘導血管內(nèi)皮細胞中BACE1水解ST6GAL-1調(diào)節(jié)VE-Cadherin的唾液酸化與功能.pdf

1、單核細胞侵襲血管內(nèi)皮層進入人內(nèi)膜最終形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化病變形成早期事件之一。該過程涉及多種糖蛋白參與，但其機制尚不清楚。本項目以血管內(nèi)皮細胞為研究對象，以α2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶1（ST6GAL1）是否通過催化 VE-Cadherin唾液酸化發(fā)揮其在細胞間緊密連接的作用，而BACE1蛋白降解途徑對ST6Gal-1可能起調(diào)控作用為研究核心，探討細胞粘聯(lián)的分子機制，尋找炎癥誘發(fā)動脈粥樣硬化的分子基礎(chǔ)。通過建立 BACE1基因過表達轉(zhuǎn)染

2、模型，采用western blot、SNA/MAA blot、免疫共沉淀技術(shù)、流式細胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡等技術(shù),檢測 TNF-α誘導前后細胞中唾液酸化和粘附功能的差異，及對PKC信號級聯(lián)系統(tǒng)的影響。以期回答糖基轉(zhuǎn)移酶是如何影響動脈硬化形成這一科學問題，為相關(guān)疾病的防治提供新的思路。本研究分為三個部分：
　　第一部分：炎癥損傷模型的建立。
　　目的：以內(nèi)皮細胞EA.hy926及RAEC細胞為研究對象，建立炎癥損傷內(nèi)皮細胞模型

3、，采用分子生物學的技術(shù)手段，分析不同內(nèi)皮細胞在炎癥因子的作用下內(nèi)皮細胞超顯微結(jié)構(gòu)和單核-內(nèi)皮粘附功能的變化，為實驗?zāi)Ｐ徒⒌於ɑA(chǔ)。
　　方法：⑴采用免疫熒光的方法，驗證EA.hy926細胞和RAEC細胞是否具有內(nèi)皮細胞特性。⑵采用CCK8法，驗證TNF-α對內(nèi)皮細胞活力的影響。⑶采用倒置顯微鏡，觀察TNF-α對內(nèi)皮細胞的影響。⑷采用細胞粘附實驗，驗證TNF-α對單核-內(nèi)皮粘附功能的影響。⑸采用透射電鏡，觀察TNF-α對內(nèi)皮細胞超

4、顯微結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：①形態(tài)學結(jié)果表明，EA.hy926細胞和RAEC細胞具有內(nèi)皮細胞特異性。②CCK8實驗及倒置顯微鏡結(jié)果顯示，TNF-α濃度在0-50ng/ml時，時間在0-24h時，不會顯著地抑制EA.hy926細胞存活率。TNF-α濃度在0-20ng/ml時，時間在0-24h時，不會顯著地抑制RAEC細胞存活率。③粘附實驗結(jié)果證實，TNF-α在0-50ng/ml范圍內(nèi)，能誘導EA.hy926細胞與THP-1細胞的粘附

5、能力顯著上升；TNF-α在0-20ng/ml范圍內(nèi)，能誘導RAEC細胞與THP-1細胞的粘附能力顯著上升。④電鏡結(jié)果表明，與對照組相比，TNF-α能破壞EA.hy926細胞的緊密連接。
　　結(jié)論：⑴EA.hy926細胞和RAEC細胞具有內(nèi)皮細胞特異性。⑵炎癥因子刺激下，單核-內(nèi)皮細胞粘附功能上調(diào)。⑶炎癥因子刺激后，影響內(nèi)皮細胞之間的緊密連接。
　　第二部分：TNF-α通過上調(diào)BACE1表達，誘導內(nèi)皮細胞中VE-Cadheri

6、n唾液酸下調(diào)，從而破壞內(nèi)皮細胞的緊密連接及上調(diào)單核-內(nèi)皮的粘附能力。
　　目的：探討在炎癥條件下 BACE1的上調(diào)是否通過降解 ST6GAL1影響VE-Cadherin唾液酸化修飾。分析BACE1水解 ST6GAL1對內(nèi)皮細胞緊密連接和單核-內(nèi)皮粘附功能的影響。
　　方法：⑴采用流式細胞術(shù)，驗證TNF-α對內(nèi)皮細胞唾液酸化的影響。⑵采用western blot和激光共聚焦顯微鏡，驗證炎癥時 BACE1水解ST6GAL1下調(diào)內(nèi)

7、皮細胞的唾液酸化。⑶采用免疫共沉淀技術(shù)，驗證VE-cadherin時炎癥誘導內(nèi)皮細胞唾液酸化下調(diào)的靶蛋白。⑷采用BACE1抑制劑（β-secretase inhibitor IV），驗證BACE1抑制劑對炎癥條件下BACE1水解ST6GAL1對內(nèi)皮細胞唾液酸化的影響及對單核-內(nèi)皮細胞粘附功能和內(nèi)皮細胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響。⑸構(gòu)建BACE1過表達模型，驗證BACE1水解ST6GAL1調(diào)控內(nèi)皮細胞唾液酸化的相關(guān)機制，并檢測其對單核-內(nèi)皮粘附功能

8、和內(nèi)皮細胞超顯微結(jié)構(gòu)的影響。
　　結(jié)果：①TNF-α刺激24h后，與對照組相比，F(xiàn)ITC-SNA標記的平均熒光強度值顯著下調(diào)，說明TNF-α誘導了EA.hy926和RAEC細胞的α2,6-唾液酸水平下調(diào)。而FITC-MAL標記的平均熒光強度值未見統(tǒng)計學意義的變化，說明TNF-α不能顯著改變RAEC細胞的α2,3-唾液酸水平。②Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，TNF-α誘導BACE1蛋白表達水平上調(diào)，同時ST6GAL

9、1及總蛋白α2,6-唾液酸水平的表達水平下調(diào)。免疫熒光實驗表明，正常的內(nèi)皮細胞的表面存在α2,6-唾液酸修飾，而TNF-α誘導后，內(nèi)皮細胞的α2,6-唾液酸修飾水平降低。③IP實驗顯示，與對照組相比，TNF-α誘導后 VE-Cadherin的唾液酸化水平顯著降低。④Western blot和免疫熒光實驗表明，BACE1抑制劑能拮抗TNF-α誘導的BACE1上調(diào)及BACE1降解ST6GAL1及下調(diào)內(nèi)皮細胞的唾液酸化。細胞粘附實驗顯示，BA

10、CE1抑制劑能拮抗TNF-α誘導的單核-內(nèi)皮粘附能力的升高。透射電鏡結(jié)果顯示，BACE1抑制劑能拮抗 TNF-α破壞內(nèi)皮細胞之間的緊密連接。⑤過表達BACE1基因后，Western blot和免疫熒光實驗表明，ST6GAL1和內(nèi)皮細胞唾液酸化的表達下調(diào)。細胞粘附實驗顯示，過表達BACE1基因后，單核-內(nèi)皮的粘附能力升高。透射電鏡結(jié)果顯示，過表達BACE1破壞內(nèi)皮細胞之間的緊密連接。
　　結(jié)論：⑴TNF-α誘導內(nèi)皮細胞唾液酸水平的下

11、調(diào)。⑵TNF-α誘導BACE1降解 ST6GAL1下調(diào)VE-Cadherin的唾液酸化，從而提高單核-內(nèi)皮細胞的粘附功能及破壞內(nèi)皮細胞的緊密連接。⑶BACE1抑制劑通過拮抗BACE1水解ST6GAL1的相關(guān)機制，從而影響單核-內(nèi)皮的粘附能力及內(nèi)皮細胞的緊密連接。⑷BACE1基因過表達后，BACE1水解 ST6GAL1，通過下調(diào)靶蛋白VE-Cadherin的唾液酸化降低了內(nèi)皮細胞的唾液酸化，從而影響單核-內(nèi)皮的粘附能力及內(nèi)皮細胞的緊密連接

12、。
　　第三部分：TNF-α上調(diào)BACE1表達的相關(guān)機制。
　　目的：探討TNF-α通過PKC/MEK/ERK信號通路上調(diào)BACE1的表達。
　　方法：⑴采用western blot，驗證TNF-α通過激活PKC的磷酸化上調(diào)BACE1的表達。⑵采用western blot，驗證PKC/MEK/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)之間的關(guān)系，并驗證TNF-α通過激活PKC/MEK/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)上調(diào)BACE1的表達。⑶采用粘附實驗，驗

13、證炎癥條件下 PKC信號通路對單核-內(nèi)皮粘附功能的影響。
　　結(jié)果：①與對照組相比，PKC的磷酸化水平顯著升高。②與對照組相比，PKC的激活劑上調(diào)了BACE1的表達(P<0.05)，PKC的抑制劑拮抗了BACE1的上調(diào)(P<0.05)。③與TNF-α組相比，PKC抑制劑組的MEK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，ERK抑制劑組的MEK磷酸化水平?jīng)]有顯著的變化(P＞0.05)（。圖3.3A、B）與TNF-α組相比，PKC抑制劑組的

14、ERK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)，ERK抑制劑組的ERK磷酸化水平顯著降低(P＜0.05)。（圖3.3C、D）與TNF-α相比，PKC的抑制劑或ERK的抑制處理后，BACE1的表達水平顯著下調(diào)(P＜0.05)。這一結(jié)果表明 TNF-α通過激活PKC/MEK/ERK信號級聯(lián)系統(tǒng)上調(diào)BACE1的表達。④與 TNF-α組相比，PMA處理后單核-內(nèi)皮的粘附能力顯著升高(P＜0.05)。PKC的抑制劑處理后單核-內(nèi)皮的粘附能力顯著降低(P