腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體TRAIL參與雷帕霉素誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷的體外研究.pdf

1、目的：探討雷帕霉素(rapamycin)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）凋亡和增殖、遷移、成血管能力的影響以及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)表達(dá)水平的變化。
　　 方法：取體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)按1×105個(gè)/孔密度接種至6孔板中并分為四組：(1)正常對(duì)照組：加入配制雷帕霉素的溶劑（含0.1％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)基）與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24h;(2)雷帕霉素各濃度干預(yù)組（共3組）：分別用1、

2、10、100ng/mL雷帕霉素（含0.01％DMSO的RPMI1640培養(yǎng)基）與內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24h。
　　 將上述四組細(xì)胞分別采用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力；transwell小室、劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；Matrigel體外成血管試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞成血管能力；DAPI染色在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變；取四組細(xì)胞提取蛋白，用特異性的activatedcaspase-3抗體的蛋白免疫印跡法(Westernblo

3、t)檢測(cè)activatedcaspase-3的表達(dá)以顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡；用特異性的TRAIL抗體的蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)TRAIL在凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：CCK-8法顯示在細(xì)胞增殖能力方面，與對(duì)照組相比，1ng/mL雷帕霉素對(duì)ECs的增殖能力無明顯影響，10～100ng/mL雷帕霉素顯著抑制ECs的增殖能力(P＜0.01)。
　　 細(xì)胞遷移能力方面，通過transwell小室、劃

4、痕試驗(yàn)均顯示雷帕霉素(1～100ng/mL)能抑制ECs的遷移能力(P＜0.01)。
　　 體外成血管能力方面，10ng/mL、100ng/mL雷帕霉素組倒置顯微鏡下(×200)計(jì)數(shù)小管數(shù)與對(duì)照組相比明顯減少。
　　 通過DAPI染色在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，雷帕霉素處理組可出現(xiàn)部分染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞核呈碎塊狀濃染等細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。
　　 采用Westorn-blotting法檢測(cè)c

5、aspase-3蛋白的活化來顯示細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示：(1-100)ng/mL雷帕霉素能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡(P＜0.01)。
　　 通過Westernblot對(duì)不同濃度雷帕霉素作用于ECs24h后細(xì)胞TRAIL蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)表明，除1ng/mL雷帕霉素作用組外，10ng/mL、100ng/mL雷帕霉素作用24h后TRAIL表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增加(P＜0.01)，且10ng/mL、100ng/mL雷帕霉素作用組與1ng/