干擾素epsilon及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體治療人卵巢癌的體外研究.pdf

1、山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文干擾素epsilon及腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體治療人卵巢癌的體外研究姓名：安紅梅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：婦產(chǎn)科學(xué)指導(dǎo)教師：郝敏20070508沒(méi)有明顯的殺傷作用，這一特殊的選擇性使其在腫瘤治療中具有很廣的應(yīng)用前景。目的：以cDNA為模板，通過(guò)RTPCR方法擴(kuò)增獲得TRA／L基因，并構(gòu)建其真核表達(dá)載體pEGFPN3TRAIL。方法：收集急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60細(xì)胞約4106個(gè)，用RNA抽提試劑盒提取細(xì)

2、胞總RNA，將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，再以cDNA為模板獲得目的基因，其反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收純化后酶切，回收酶切產(chǎn)物，插入經(jīng)相同酶切的質(zhì)粒pEGFPN3中，連接酶連接過(guò)夜，構(gòu)建成真核表達(dá)載體pEGFPN3TRAIL，通過(guò)酶切后電泳鑒定，經(jīng)測(cè)序證實(shí)其插入序列的正確性。結(jié)果：l、TRA／L基因的提?。篐L—60細(xì)胞的RTPcR產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)在865bp處有一條清楚的條帶

3、。2、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)XhoI和EcoRI雙酶切后，凝膠電泳，可見(jiàn)兩條清楚條帶；47kb為pEGFPN3質(zhì)粒，865bp為插入的TRA／L目的基因，測(cè)序證實(shí)目的基因刀翻，上以讀框融合的方式插入表達(dá)質(zhì)粒pE6FPN3，并與Genebank中報(bào)道的豫4尼序列一致。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功提取了基因TRA／L并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測(cè)序證實(shí)正確，為進(jìn)一步研究TRAⅡ，對(duì)卵巢癌細(xì)胞的作用奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：RTPCR，TR

4、AIL，基因克隆第三部分轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒對(duì)卵巢癌細(xì)胞作用的體外研究目的：初步探討轉(zhuǎn)染真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN3TRAIL和PcDNA31IFN￡后對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外作用及其機(jī)制。方法：人卵巢癌細(xì)胞株SKOv3體外培養(yǎng)達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)分為六組進(jìn)行：pEGFPN3TRAIL轉(zhuǎn)染組，PcDNA31IFN6轉(zhuǎn)染組，兩者聯(lián)合轉(zhuǎn)染組，空質(zhì)粒pEGFPN3轉(zhuǎn)染，PcDNA31轉(zhuǎn)染組，PBS對(duì)照組。采用MTT法測(cè)定不同轉(zhuǎn)染組

5、對(duì)人卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)觀察兩者作用于卵巢癌細(xì)胞后的細(xì)胞凋亡情況，RTPCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組Survivin的表達(dá)水平。結(jié)果：pEGFPN3TRAIL和PcDNA31IFN噸轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，可見(jiàn)卵巢癌細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，部分呈懸浮狀態(tài)；pEGFPN3TRAIL轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)可清楚看到綠色熒光蛋白的表達(dá)。轉(zhuǎn)染24h，48h，96h后PcDNA31IFN￡轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為1453％，3019

6、％、4505％，明顯高于周一時(shí)間PcDNA31空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組O51％、384％、695％)和PBS對(duì)照組(167％、249％、308％)(P001)；pEGFPN3TRAIL轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為1800％，2551％、4743％，明顯高于同一時(shí)間pEGFPN3空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(503％、497％、760呦和PBS對(duì)照組(PO01)；pEGFPN3TRAILPcDNA3IIFN8轉(zhuǎn)染組的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為3668％、5643％、7