人腫瘤壞死因子樣弱凋亡因子的克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、目的:(1)從中國人組織細(xì)胞中克隆TWEAK cDNA的全長序列和可溶性胞外區(qū)編碼基因sTWEAK1和sTWEAK2(sTWEAK1為TWEAK的150~767bp,而sTWEAK2為TWEAK的144~767bp);(2)將TWEAK胞外區(qū)編碼基因在大腸桿菌中進(jìn)行融合表達(dá),并對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化;(3)研究融合蛋白的細(xì)胞凋亡作用及其可能的作用機制;(4)構(gòu)建TWEAK腺病毒表達(dá)載體,在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),并評價TWEAK基因

2、治療惡性腫瘤的可能性.方法:(1)該研究用RT-PCR方法,從人組織細(xì)胞總RNA中擴增可溶懷TWEAK胞外區(qū)(sTWEAK1和sTWEAK2)的cDNA序列及全長編碼序列,用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物,膠回收目的基因片段,連接到pMD18-T克隆載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌K802,PCR和酶切篩選陽性克隆,全自動DNA測序驗證序列;(2)sTWEAK1和sTWEAK2分別亞克隆到pProEx HTb和pMAL-C2x表達(dá)載體中,分別轉(zhuǎn)化大腸

3、桿菌BL21和TB1,PCR篩選和酶切鑒定,陽性克隆用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物用SDS-PAGE分析和Western blot驗證融合蛋白;(3)用NTA-Ni Spin試劑盒初步分離純化sTWEAK1融合蛋白;(4)用體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和正常對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行活性檢測,貼壁細(xì)胞用結(jié)晶紫染色法,懸浮細(xì)胞用磺酰羅丹明B染色法,酶標(biāo)儀檢測OD值;(5)敏感細(xì)胞用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-8的含量;(6)用光鏡和電鏡觀察敏感細(xì)胞死亡和

4、細(xì)胞凋亡情況;(7)用流式細(xì)胞儀分析表達(dá)產(chǎn)物對敏感細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響;(8)用雙熒光素酶報告基因檢測法,測定表達(dá)產(chǎn)物對敏感細(xì)胞NF-κB的影響;(9)用pShuttle穿梭質(zhì)粒TWEAK重組到腺病毒載體上,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,PCR鑒定重組質(zhì)粒.結(jié)論:(1)TWEAK胞外區(qū)在大腸桿菌中獲得較高的可溶性融合表達(dá);(2)TWEAK胞外區(qū)融合蛋白具有明顯的生物學(xué)活性.可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡.刺激敏感細(xì)胞IL-8分泌增多