快速篩選重組羊口瘡病毒NA1-11△132以及構(gòu)建表達(dá)EV71 VP1蛋白的重組羊口瘡病毒NA1-11-VP1.pdf

1、羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)屬于痘病毒科（Poxviridae）脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxrinae）中的副痘病毒屬（Parapoxvirus），是非整合宿主染色體，在胞漿內(nèi)復(fù)制的有囊膜的雙鏈DNA核酸病毒，其堿基數(shù)可達(dá)到134-139kb，GC含量高達(dá)64％，中間區(qū)域高度保守，為病毒復(fù)制的必須基因，末端為反向重復(fù)的堿基序列，為一般致病性、毒力、嗜宿主和組織的功能基因。
　　ORFV宿主范圍窄，主要感染綿

2、羊和山羊，有時(shí)也會(huì)感染馴鹿、麝香牛，甚至人類。其主要通過接觸破損的皮膚傳播，引起口唇、鼻孔、眼部及乳房周圍皮膚的化膿性感染，偶爾也會(huì)引起其他器官如胃、腸、呼吸道的感染，但是具有自限性，不會(huì)引起全身性病毒播散，總體致死率非常低。但是妊娠的母羊、年幼或者免疫缺陷的羔羊若患此病，其致死率非常高，可以達(dá)到80％以上。傳統(tǒng)的羊口瘡病毒疫苗主要以滅活疫苗或弱毒疫苗為主，但滅活疫苗通常不能有效激活細(xì)胞免疫，而弱毒活疫苗則存在非疫區(qū)擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，因此限制了

3、其運(yùn)用。利用基因工程技術(shù)敲除ORFV的相關(guān)毒力基因可獲得減毒的活病毒疫苗，成為羊口瘡病毒疫苗研究新熱點(diǎn)。羊口瘡病毒編碼血管內(nèi)皮生長因子基因(Vascularendothelial growth factor，VEGF)，該基因編碼的VEGF蛋白與哺乳動(dòng)物表達(dá)的VEGF具有高度的同源性，可以與血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)結(jié)合，調(diào)節(jié)血管生成，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性，引起充血水腫的炎癥反應(yīng)，是其主要的致病性基因。病毒的VEG

4、F分子可使感染后期易于形成結(jié)痂，而較多的結(jié)痂有助于病毒長期存活。利用基因工程技術(shù)去除該致病性基因得到的ORFV突變體也許能成為新型的減毒活病毒疫苗候選物。另外，ORFV是一種潛在的溶瘤病毒，Rintoul等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ORFV不易在正常人體組織復(fù)制，但是在腫瘤組織卻有強(qiáng)大的復(fù)制功能，并且在肺癌模型上取得了顯著的治療效果。除此之外，國外已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，羊口瘡病毒VEGF基因的位置非常適合表達(dá)外源抗原，并利用減毒的羊口瘡病毒D1701-

5、V為載體成功表達(dá)了針對(duì)皰疹病毒、兔出血熱疾病病毒、狂犬病病毒、甲型流感病毒H5N1和H1N1的疫苗候選物，其免疫保護(hù)作用持久穩(wěn)定，不需要佐劑即能強(qiáng)力誘導(dǎo)Th1-Th2平衡的先天免疫和獲得性免疫反應(yīng)。短期的ORFV感染不能誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生，因此可以使用同一或不同的該病毒重組體反復(fù)接種免疫。而且ORFV只在胞漿中復(fù)制，不會(huì)插入宿主細(xì)胞染色體引起基因突變，安全性較高，可能成為未來理想的克隆表達(dá)載體。
　　截止目前為止，除了新西蘭

6、株羊口瘡病毒NZ2進(jìn)行了詳細(xì)的全基因遺傳結(jié)構(gòu)功能分析外，美國株IA82，德國株D1701以及中國株NA1/11也進(jìn)行了基因序列分析比較。中國株NA1/11為中國吉林省一次爆發(fā)的羊痘瘡疾病分離所得，其132基因編碼血管內(nèi)皮生長因子VEGF。本次實(shí)驗(yàn)中，我們利用同源重組的方法敲除羊口瘡病毒株NA1/11的132基因，通過綠色熒光標(biāo)記蛋白快速篩選出減毒的重組羊口瘡病毒NA1/11△132，并通過體外實(shí)驗(yàn)，初步證明132基因?yàn)檠蚩诏彶《綨A1/

7、11生長復(fù)制的非必需基因，且外源基因GFP的插入并不會(huì)影響病毒體外的感染復(fù)制特性，但132基因的敲除可以使ORFV減少VEGF的分泌，減輕了病毒的毒力。利用已構(gòu)建的快速病毒基因敲除方法，我們以手足口病EV71 VP1基因替換了羊口瘡病毒NA1/11的132基因，通過綠色熒光信號(hào)成功獲得純化的重組羊口瘡病毒突變株，命名為NA1/11-VP1，以期構(gòu)建手足口病的疫苗候選物。
　　研究內(nèi)容包含兩個(gè)部分:
　　第一部分:快速篩選重組

8、羊口瘡病毒NA1/11△132
　　綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)最早是由下村修等人于1962年在一種學(xué)名Aequoreavictoria的水母中發(fā)現(xiàn)。GFP作為一種報(bào)告分子，廣泛運(yùn)用于細(xì)菌、植物甚至人類等研究，在蛋白表達(dá)檢測、蛋白和細(xì)胞熒光示蹤、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及功能的研究中具有重要意義。傳統(tǒng)重組病毒的篩選主要通過新霉素抵抗和β-葡萄糖醛酸苷酶(neomycinresistance and

9、β-glucuronidase，neo/gus)藍(lán)白斑篩選，該方法不易把握，操作麻煩，且耗時(shí)長。為了更簡單，快速篩選出減毒的重組羊口瘡病毒，在本研究中，我們?cè)诰哂芯G色熒光蛋白GFP標(biāo)簽的pSPV-EGFP質(zhì)粒上插入了羊口瘡病毒NA1/11的132基因左右同源臂，經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定，命名為pSPV-132L-EGFP-132R。然后將該穿梭質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染感染了NA1/11的羊胚胎鼻甲骨細(xì)胞(Primary ovine feta

10、l turbinate，OFTu)，經(jīng)過2輪96微孔板稀釋和3輪六孔板蝕斑純化實(shí)驗(yàn)后，將篩選出來的病毒擴(kuò)大培養(yǎng)，36小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡下，可以觀察到視野中有大量熒光信號(hào)，提取病毒核酸經(jīng)PCR驗(yàn)證，羊口瘡病毒的132基因已敲除并且檢測到了GFP基因，將缺失132基因的羊口瘡病毒命名為NA1/11△132，并經(jīng)病毒滴定、體外血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以檢測132基因缺失后的功能影響。
　　第二部分:構(gòu)建表達(dá)EV71 VP1蛋白的重組羊

11、口瘡病毒NA1/11-VP1
　　國外相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ORFV的VEGF基因位置非常適合插入外源抗原。本次實(shí)驗(yàn)希望以羊口瘡病毒NA1/11為表達(dá)載體，通過同源重組的方法構(gòu)建表達(dá)腸道病毒71型VP1蛋白的重組羊口瘡病毒NA1/11-VP1。本實(shí)驗(yàn)首先抽提手足口病EV71的RNA，擴(kuò)增EV71的VP1全基因，并擴(kuò)增質(zhì)粒pCMVTAG4a早期啟動(dòng)子CMV，按照先后順序插入質(zhì)粒pSPV-132L-EGFP-132R中構(gòu)建重組質(zhì)粒pSPV-

12、EGFP/VP1;轉(zhuǎn)染OFTu細(xì)胞，與羊口瘡病毒NA1/11同源重組，通過熒光信號(hào)純化重組羊口瘡病毒NA1/11-VP1，抽提重組羊口瘡病毒核酸，進(jìn)行PCR、測序驗(yàn)證EV71 VP1基因的存在以及132基因的缺失，并且經(jīng)過間接免疫熒光以及免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測手足口病EV71 VP1蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羊口瘡病毒NA1/11的VEGF基因位置的GFP蛋白成功表達(dá)，可以檢測到綠色熒光信號(hào)，但是同樣插在VEGF基因位置上的EV71 V

13、P1基因卻沒有表達(dá)，使用EV71 VP1單抗和多抗均無法檢測到VP1蛋白。
　　小結(jié):
　　根據(jù)以上兩個(gè)部分的研究，本研究小結(jié)如下:
　　1、利用GFP作為報(bào)導(dǎo)基因成功篩選出減毒的重組羊口瘡病毒NA1/11△132，其132基因的敲除以及GFP基因的存在已經(jīng)通過PCR和基因測序驗(yàn)證。
　　2、本次實(shí)驗(yàn)證實(shí)以綠色熒光蛋白為報(bào)導(dǎo)基因的重組病毒篩選方法具有以下優(yōu)點(diǎn):直觀:通過熒光信號(hào)即可以判斷同源重組效率的高低，為進(jìn)行

14、下一輪篩選實(shí)驗(yàn)提供參考依據(jù)，比傳統(tǒng)方法更直觀，操作性更強(qiáng);快速:重組病毒的篩選時(shí)間短，蝕斑篩選時(shí)間不超過15天，而傳統(tǒng)的蝕斑篩選方法需要3-4個(gè)月的時(shí)間;廉價(jià):不需要借助貴重儀器即可分離重組病毒。雖然以GFP為報(bào)導(dǎo)基因，借助流式細(xì)胞分選儀，可以快速分選出重組病毒，但是流式細(xì)胞分選儀價(jià)格昂貴，而且病毒分選存在污染問題，因此不易推廣使用;科學(xué):利用熒光信號(hào)進(jìn)行蝕斑篩選不需要添加抗生素和反應(yīng)底物，比傳統(tǒng)方法更科學(xué)，更經(jīng)濟(jì)。
　　3、通過

15、體外實(shí)驗(yàn)，初步證明132基因?yàn)镺RFV生長復(fù)制的非必需基因，且外源基因GFP的插入并不會(huì)影響病毒感染復(fù)制特性，但132基因的敲除可以使病毒減少VEGF的分泌，減輕了病毒的毒力。
　　4、羊口瘡病毒的VEGF基因位置適合表達(dá)外源抗原蛋白，但是同一基因位點(diǎn)的表達(dá)不能采用雙啟動(dòng)子，不能同時(shí)啟動(dòng)兩種不同的外源蛋白表達(dá)，避免其中一個(gè)啟動(dòng)子不工作;
　　5、在同一基因位點(diǎn)同時(shí)表達(dá)EV71 VP1和GFP蛋白，GFP蛋白的空間構(gòu)象可能影響