抗EV71病毒衣殼蛋白VP1卵黃抗體IgY的制備和鑒定.pdf

1、目的：對腸道病毒71型(EV71)的BrCr株進行細胞培養(yǎng)，從細胞培養(yǎng)的EV71病毒中提取RNA，并擴增EV71的BrCr株衣殼蛋白VP1基因，用于構(gòu)建原核表達載體PET28a/VP1，表達VP1重組蛋白。以VP1免疫產(chǎn)蛋母雞，獲得抗VP1的雞免疫球蛋白Y(IgY)，并對其進行鑒定，用于手足口病預防和治療的探索。
　　 方法：培養(yǎng)EV71敏感的非洲綠猴腎細胞(Vero)，利用Vero細胞增殖腸道病毒EV71 BrCr株，提取病毒

2、總RNA，利用RT-PCR擴增出VP1目的基因，目的基因插入克隆載體pGEM-T，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHI，EcoRI雙酶切獲得目的基因，插入原核表達載體pET-28a，重組子同時經(jīng)BamHI，EcoRI雙酶切和測序鑒定，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)工程菌E.coli BL21(DE3)，獲得陽性重組工程菌，經(jīng)IPTG誘導獲得表達融合蛋白，試劑盒純化蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting鑒定后，用VP1蛋白免疫開產(chǎn)母雞，收集雞蛋，

3、利用EGG stractTM IgY Purification System試劑盒提取卵黃抗體IgY，間接ELISA測滴度，SDS-PAGE和Western blotting驗證其表達量和免疫活性。結(jié)果擴增出腸道病毒EV71 BrCr株衣殼蛋白VP1基因，獲得了含重組表達質(zhì)粒pET28a/VP1的陽性工程菌株，經(jīng)IPTG誘導能高效表達VP1融合蛋白，VP1經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting鑒定后，在約38kD左右顯示一