2009-2011年廣東EV71致手足口病臨床病原特征及EV71衣殼蛋白P1單克隆抗體制備.pdf

1、手足口?。╤and，foot，mouthdisease,HFMD）是以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹、皰疹為特征的兒童常見病。絕大部分病情較輕，少數(shù)可發(fā)生嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥并致相當(dāng)數(shù)量?jī)和劳?，是中國及亞洲的主要公共衛(wèi)生問題之一。
　　 HFMD由人類腸道病毒(humanenterovirus，HEV)感染引起。其中腸道病毒71型(EV71)是最重要的的病原體，因其更易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)感染甚至死亡。EV71屬小RNA病毒科，成熟E

2、V71病毒顆粒外殼由60個(gè)拷貝的P1蛋白組成，P1又分為VP1-VP4四種衣殼蛋白。按照VP1區(qū)不同EV71分A、B、C三個(gè)基因亞型，中國大陸流行C4亞型。臨床實(shí)驗(yàn)室HFMD病原學(xué)診斷以分子生物學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)為主。目前，尚無有效的抗病毒藥物和疫苗防治EV71感染。對(duì)于EV71外殼抗原結(jié)構(gòu)、中和性表位及其在病毒致病機(jī)制中的作用的認(rèn)識(shí)還很有限。已證實(shí)VP1、VP2、VP3具中和活性抗原位點(diǎn)，VP1是最主要的抗原決定簇，VP4雖位于病毒表面內(nèi)

3、側(cè)，但能產(chǎn)生相應(yīng)抗體，推測(cè)其可能參與抗體依賴感染增強(qiáng)效應(yīng)(ADE)而加強(qiáng)病毒對(duì)機(jī)體的攻擊。
　　 本研究對(duì)象系地區(qū)發(fā)生的HFMD進(jìn)行病原學(xué)監(jiān)測(cè)。收集了2009-2011年EV71流行株及所致疾病的臨床特征、基因分型及其來源、變遷及突變等信息，為控制和預(yù)防HFMD提供預(yù)警及對(duì)策的參考資料;采用多種目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)病毒的方法對(duì)臨床常用的捕獲ELISA發(fā)檢測(cè)抗EV71-IgM用于EV71病原診斷進(jìn)行評(píng)估，使臨床更合理使用;在此基礎(chǔ)上，采

4、用載體pQE30a和大腸桿菌M15系統(tǒng)重組表達(dá)了EV71臨床分離株的VP1～4蛋白，通過免疫小鼠獲得針對(duì)這些蛋白的單克隆抗體，為研究EV71病毒衣殼的抗原結(jié)構(gòu)及功能、揭示EV71致病機(jī)制以及疫苗制備提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究包含三個(gè)部分內(nèi)容:
　　 第一部分:2009-2011年EV71致手足口病臨床及病原學(xué)特征
　　 2009～2011年來自廣東各地在我院就（轉(zhuǎn)）診的臨床診斷HFMD（含皰疹性咽峽炎）分別有107、553、5

5、79例，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR對(duì)腸道病毒通用型核酸檢出率分別為87.9％(94/107)、91.2％(505/553)和88.8％(515/579)，EV71占所有病原的比例分別為28.1％(30/107)、45.6％(252/553)和38.7％(221/579)，顯示EV71仍為廣東手足口病最主要病原。
　　 1239例患者中男性813例，女性426例，男女比1.91，EV71感染性別比與全部EV感染無差異(P=0.765)。

6、患者年齡最小1個(gè)月，最大35歲，中位數(shù)分別是2.08歲、2.58歲和2.41歲;1歲和2歲是發(fā)病最多的兩個(gè)年齡段，占73.2％，4歲以下兒童占患者總數(shù)85.0％;6個(gè)月以下發(fā)病者21例，EV71感染8例;各年齡段感染EV71與EV感染比例相似。診斷為重癥手足口病81例，年齡最小4個(gè)月，最大10歲，中位數(shù)2.0歲，1～2歲是出現(xiàn)重癥最多的年齡段，各年齡段重癥手足口病例與普通手足口病例相似;男女比:2.24:1，略高于全部患兒性別比，但無統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)差異(P=0.62)，提示重癥并不傾向于男孩。
　　 監(jiān)測(cè)顯示2009-2011年廣東以散發(fā)流行為主。每年出現(xiàn)兩個(gè)發(fā)病高峰:初夏（5、6月間）和秋季（10、11月），2010年5月中旬達(dá)最高峰，持續(xù)約1個(gè)月，10月出現(xiàn)小高峰;2011年發(fā)病高峰期推遲至半個(gè)月，春夏季EV71導(dǎo)致的HFMD較秋季略高。
　　 臨床發(fā)現(xiàn)以手掌、臀部、足底斑疹，口腔皰疹為主。90％以上有出疹，60％以上發(fā)病初期有發(fā)熱伴出疹，順序不一。少數(shù)(

8、7.2-11.3％)表現(xiàn)呼吸道感染癥狀。極少數(shù)出現(xiàn)神經(jīng)性癥狀，如嘔吐、抽搐、驚跳或頭痛等。EV71感染臨床表現(xiàn)與EV所致HFMD相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2010～2011年分別有89和144例患兒經(jīng)ICU治療，其中EV感染分別是75例(14.9％)和128例(24.9％)。EV71感染較EV感染更多需要ICU治療(P值分別為0.037和0.000)。所有診斷為重癥手足口病者均有腸道病毒相關(guān)性腦病發(fā)生，如病毒性腦炎等，呼吸道并發(fā)癥主要是神經(jīng)源

9、性肺水腫。
　　 擴(kuò)增測(cè)序33株2009～2010年臨床分離EV71（2009年5株，2010年28株）的部分VP1區(qū)，經(jīng)比對(duì)分析，確定均屬C4a亞型，與廣東歷年分離毒株序列比較未見明顯差異;與2008年阜陽EV71流行株比較亦未見明顯差異，表明為國內(nèi)循環(huán)流行株;與臺(tái)灣近年流行株的基因亞型不同，表明兩岸毒株進(jìn)化來源不同。通過ClustalW軟件對(duì)臨床分離株與標(biāo)準(zhǔn)株BrCr(U22521)、臺(tái)灣1998年流行株(Taiwan98)

10、比對(duì)VP1區(qū)序列:核苷酸相似度93.7％-100％，氨基酸相似度97.0％-100％。第22、98號(hào)位氨基酸與臺(tái)灣98年流行株和標(biāo)準(zhǔn)株BrCr略有不同。
　　 第二部分:實(shí)時(shí)熒光RT-PCR和EV71-IgM捕獲ELISA法對(duì)EV71致手足口病診斷的評(píng)估
　　 為評(píng)估捕獲ELISA法檢測(cè)EV71-IgM，我們收集了從發(fā)病第1天到158天的134例EV71感染血清256份，發(fā)現(xiàn)發(fā)病第1天即可檢出EV71-IgM，隨發(fā)病天數(shù)

11、增多檢出率升高，第5天達(dá)100％;發(fā)病3個(gè)月后血清EV71-IgM檢出率明顯下降。急性期（發(fā)病7天內(nèi)）血清檢測(cè)敏感度90.2％(138/153)，發(fā)病90天內(nèi)敏感度93.6％(233/249)。
　　 與CA16-IgM檢測(cè)存在交叉反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)顯示122份CA16感染血清中38份EV71-IgM陽性，49份其它腸道病毒感染血清中14份EV71-IgM陽性，105份其它呼吸道病毒感染血清有2份（來自同一呼吸道合胞病毒A和B型雙重感染

12、患者）EV71-IgM陽性。對(duì)于其它腸道病毒，EV71-IgM捕獲法ELISA法檢測(cè)特異性為69.6％(52/171，95％可信區(qū)間:65.2-72.4％)，對(duì)于其它呼吸道病毒特異性98.1％(2/105，95％可信區(qū)間:96.5-99.5％)，檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值81.3％(95％可信區(qū)間:76.9-85.1％)，陰性預(yù)測(cè)值91.0％（95％可信區(qū)間:87.5-93.8％）。206份EV71感染血清檢出EV71-IgM陽性199份（95.7

13、％)、CA16-IgM陽性58份(28.2％)，其中EV71-IgM的OD值高于CA16-IgM者56份（占96.6％）;119份CA16感染血清CA16-IgM陽性83份(69.7％)，EV71-IgM陽性36份(30.3％)，其中CA16-IgM的OD值高于EV71-IgM者33份（占91.7％），實(shí)際感染的病原產(chǎn)生的IgM檢測(cè)OD值更高，可正確區(qū)分大部分感染病原體。
　　 111例同日收集的肛拭子和血清標(biāo)本分別用ELISA

14、和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR兩種方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種方法診斷EV71感染無顯著性差異（McNemar'sx2檢驗(yàn)P=0.648），一致性較好（Kappa值0.729）。
　　 第三部分EV71病毒衣殼蛋白P1單抗的制備
　　 依據(jù)EV71基因序列信息(FJ194965.1)設(shè)計(jì)VP1～VP4基因全長序列引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，KpnⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物，連接載體pQE30a，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)與原始序列完全一致后將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大

15、腸桿菌M15。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)VP1～VP4蛋白，均以包涵體形式存在，以8M尿素變性及梯度復(fù)性，復(fù)性蛋白經(jīng)HisBindResin層析柱純化，獲得純化VP1～4蛋白。以重組VP4蛋白與純化EV71病毒交替免疫小鼠，經(jīng)小鼠脾細(xì)胞與雜交瘤細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞克隆，分別采用重組蛋白VP1～4和病毒液包被ELISA、間接免疫熒光法篩選克隆，采用免疫印跡鑒定針對(duì)的靶蛋白。
　　 以EV71病毒液、溶于8M尿素的重組蛋白VP1、VP2和VP4分

16、別包被板條，ELISA檢測(cè)融合細(xì)胞克隆上清，挑選OD值高的克隆，進(jìn)一步間接免疫熒光法對(duì)EV71感染和未感染RD細(xì)胞反應(yīng)，篩選僅對(duì)EV71感染RD細(xì)胞有陽性熒光的克隆。克隆上清采用純化EV71病毒液和重組VP1～VP4蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離的蛋白組分進(jìn)行免疫印跡反應(yīng)鑒定抗體針對(duì)的靶蛋白。初步獲得25株針對(duì)P1蛋白的單抗:6株針對(duì)EV71病毒VP1蛋白（天然蛋白），其中4株對(duì)重組VP1蛋白有反應(yīng);3株僅針對(duì)重組VP2蛋白:2株針對(duì)病毒

17、VP1和VP2蛋白，其中針對(duì)重組VP1和VP2各一株;1株針對(duì)重組蛋白VP4;另有13株目前尚未鑒定出針對(duì)的靶蛋白。
　　 小結(jié)
　　 根據(jù)以上三個(gè)部分的研究成果，本研究小結(jié)如下:
　　 1.2009-2011年監(jiān)測(cè)EV感染手足口病患者病原，EV71感染分別是:30、252和221例，分別占28.1％(30/107)、45.6％(252/553)和38.7％(221/579)，EV71仍為廣東手足口病最主要病原。

18、
　　 2.2009-2011年廣東以散發(fā)為主，每年出現(xiàn)一大一小兩個(gè)發(fā)病高峰，即初夏（5、6月之間）和秋季（10、11月）;1、2歲是發(fā)病最多的年齡段，占73.2％，4歲以下兒童占總數(shù)85.0％;EV71感染致重癥手足口病患者年齡分布與此相似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.2009～2010年廣東EV71臨床分離株屬C4a亞型，與廣東歷年分離株和08年安徽阜陽流行株序列比較未見差異，為國內(nèi)循環(huán)流行毒株;與臺(tái)灣近年流行株比較，

19、為不同基因亞型，提示兩地毒株進(jìn)化來源不同;與標(biāo)準(zhǔn)株BrCr、臺(tái)灣1998年流行株Taiwan98VP1區(qū)核苷酸相似度93.7％-100％，氨基酸相似97.0％-100％。第22、98號(hào)位氨基酸于臺(tái)灣98年流行株和標(biāo)準(zhǔn)株BrCr略有不同。
　　 4.捕獲ELISA法EV71-IgM檢測(cè)診斷EV71致手足口病急性期敏感度為90.2％(138/153)，特異性分別為69.6％52/171，相對(duì)其他腸道病毒）和98.1％（2/105，相

20、對(duì)其他呼吸道病毒），檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值81.3％(95％可信區(qū)間:76.9-85.1％)，陰性預(yù)測(cè)值91.0％(95％可信區(qū)間:87.5-93.8％)。與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法診斷EV71感染無顯著性差異(McNemar'sx2檢驗(yàn)P=0.648），一致性較高。該方法適用于臨床。
　　 5.捕獲ELISA法EV71-IgM檢測(cè)診斷EV71雖然對(duì)CA16感染HFMD血清有交叉反應(yīng)性（28.2％和30.3％），但較高的OD值可以反映感