阜陽地區(qū)2011~2012年手足口病流行病原譜及EV71基因型進(jìn)化分析.pdf

1、目的：手足口病(hand,footand mouth disease,HFMD)是一種常見的兒童傳染病,其病原體型別眾多,除CA16和EV71外,還有其它腸道病毒。本研究采用從阜陽地區(qū)HFMD患兒標(biāo)本中分離病毒的方法得到EV71、CA16分離株和其他腸道病毒分離株;利用分子生物學(xué)技術(shù)以其他腸道病毒的基因組為模板,擴(kuò)增腸道病毒VP4基因序列,確定該毒株的型別:并對典型的分離株進(jìn)行分子流行病學(xué)分析,了解其核苷酸及氨基酸變異情況,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化

2、樹;同時(shí)擴(kuò)增EV71分離株的全基因組序列并測序,與國內(nèi)外EV71毒株進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析,了解阜陽地區(qū)HFMD流行病原譜和EV71分離株的分子流行病學(xué)特征,為手足口病的防治及疫苗研究工作提供參考。
　　方法：本研究主要由四部分內(nèi)容組成:(1)HFMD患兒咽拭子標(biāo)本的病毒分離與鑒定:首先將采自臨床診斷為HFMD的患兒的133份咽拭子標(biāo)本分別接種RD細(xì)胞和HEp-2細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。將分離得到的可疑病毒株利用透射電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察

3、,同時(shí)用腸道病毒通用引物、EV71型特異性引物和CA16型特異性引物進(jìn)行Real-timeRT-PCR檢測,以對分離物進(jìn)行初步的型別鑒定;(2)非EV71非CA16腸道病毒株的鑒定及其VP4基因分型研究:對Real-timeRT-PCR檢測鑒定為腸道病毒,但又不是EV71和CA16的病毒株擴(kuò)增其VP4基因序列并測序,測序結(jié)果與GenBank腸道病毒核苷酸序列經(jīng)BLAST比對確定其型別,并對其核苷酸序列進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析;(3)對通

4、過VP4比對鑒定為脊髓灰質(zhì)炎病毒(Polioviruses,PV)的毒株VP1基因片段進(jìn)行PCR產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)分析,并擴(kuò)增其VP1片段,將其插入至pMD18-Tsimple克隆載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,進(jìn)行PCR鑒定及序列測定,并將序列與Sabin1標(biāo)準(zhǔn)株的VP1序列進(jìn)行比對;(4)EV71地方流行株的全基因組序列擴(kuò)增和測序:選取三株經(jīng)Real-timeRT-PCR檢測鑒定為EV71

5、的分離株進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)鑒定,擴(kuò)增其全基因組序列,連接T載體后轉(zhuǎn)化到克隆載體中,提取質(zhì)粒鑒定后并測序,將該核苷酸序列與國內(nèi)外EV71毒株進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化分析。
　　結(jié)果：(1)本次研究中,從133例患兒標(biāo)本中分離出疑似腸道病毒株52例,病毒分離陽性率為39.1％(52/133)。經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),在RD細(xì)胞胞漿中,可見直徑約30nm的球形無包膜腸道病毒樣顆粒;通過熒光PCR鑒定為EV71為11株,占陽性比例為21.2%;CA16

6、有5株,占陽性比例為9.6%;非EV71非CA16的其他腸道病毒36株,占陽性比例為69.2%。(2)成功擴(kuò)增了36株非EV71非CA16其他腸道病毒的VP4片段,通過測序比對確定了34株的型別,病毒型別分布較為廣泛,既有柯薩奇A組病毒,也有柯薩奇B組病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV),幾組病毒伴隨同時(shí)流行,其中CA10所占的比例最高(52.8%),其次為CA4(13.9%);(3)對確定為PV的FY11039號毒株VP1基因進(jìn)行PCR-RF

7、LP,分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)HaeⅢ、DdeⅠ內(nèi)切酶作用后FY11039與標(biāo)準(zhǔn)株Sabin1的圖譜一致,提示它們屬于同一型,但經(jīng)HpaⅡ內(nèi)切酶作用后,FY11039與標(biāo)準(zhǔn)株Sabin1的圖譜不一致,在對其VP1基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)126位核苷酸存在突變,由G突變成A,而對其氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)序列并未發(fā)生變異;(4)對三株EV71分離株進(jìn)行全基因組擴(kuò)增,通過分析發(fā)現(xiàn),它們與EV71A型代表株BrCr的同源性較低(79.55%～79.64%);與C4亞

8、型的同源性較高(92.25%～99.60%)。
　　結(jié)論：(1)基于VP4基因擴(kuò)增和序列測定方法可以快速簡便的初步鑒別HEV的型別,在應(yīng)對HEV引起的突發(fā)疫情病原學(xué)診斷方面具有重要的意義;(2)有些PV毒株的VP1核苷酸序列126位存在突變,HpaⅡ內(nèi)切酶可能無法進(jìn)行酶切,提示我們這種PCR-RFLP可能不再完全適用于對以后的PV分離株進(jìn)行型內(nèi)鑒定;(3)通過對EV71進(jìn)行全基因組序列測定和分析,初步判斷2012年阜陽地區(qū)流行的E