抗幽門螺桿菌特異性卵黃抗體IgY制備和效果評價(jià).pdf

1、幽門螺旋桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）是引起胃相關(guān)疾病的重要因素，世界衛(wèi)生組織將其列為Ⅰ類致癌因子。目前“三聯(lián)”或“四聯(lián)”療法是臨床治療H.pylori相關(guān)疾病的主要手段，但是耐藥菌株的出現(xiàn)導(dǎo)致該方法的治愈率越來越低，因此開發(fā)高效、安全、經(jīng)濟(jì)且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性的藥物顯得尤為迫切和重要。
　　卵黃抗體（Specific eggyolk immunoglobulin）IgY，是禽類主要的血清免疫球蛋白，

2、國內(nèi)外研究表明幽門螺桿菌全菌或某類致病因子的重組蛋白制備的抗H.pylori特異性IgY也可以達(dá)到治療感染H.pylori的效果。
　　H.pylori在胃部低pH(＜2)情況下利用尿素酶水解從血液中擴(kuò)散出的尿素為氨水和二氧化碳，在菌體周圍形成“氨云”中和胃酸。有利于H.pylori穿過胃黏液層，定植于胃上皮細(xì)胞表面。H.pylori尿素酶B亞單位是主要的功能單位，包含尿素酶的活性中心。尿素酶膜通道蛋白UreI對幽門螺桿菌在人和動(dòng)

3、物體內(nèi)生存起關(guān)鍵作用。
　　本實(shí)驗(yàn)在前期對H.pylori的ureI和ureB基因的生物學(xué)作用進(jìn)行研究的基礎(chǔ)上，成功的制備了抗SS1全菌的IgY和抗重組尿素酶的IgY，擬通過此體外抑菌實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評價(jià)兩種IgY抗體的治療效果，為最終制備治療性抗幽門螺桿菌特異性抗體制劑提供基礎(chǔ)研究材料。本實(shí)驗(yàn)的研究方法，結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.制備SS1-IgY和IB-IgY
　　以超破SS1菌液和IB重組蛋白為抗原免疫蛋雞

4、;水稀釋法和兩次硫酸銨沉淀法分離純化IgY; SDS-PAGE檢測純度，ELISA檢測效價(jià)，K5600檢測濃度。純化后的兩種IgY純度均超過80％，效價(jià)超過1∶12800，濃度可達(dá)30mg/ml。
　　2.兩種IgY體外抑菌效果評價(jià)
　　分別將兩種特異性IgY與新鮮H.pylori菌液混合后涂板孵育，對菌落克隆數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。SS1-IgY組和IB-IgY組與生理鹽水組相比差異顯著，說明兩種IgY均可在體外抑制Hpylori

5、的生長。
　　3.兩種Igy對尿素酶的抑制作用
　　將新鮮H.pylori菌液超聲破碎后得到含有大量尿素酶的溶液，將其分別與兩種IgY混合孵育后進(jìn)行快速脲酶檢測。結(jié)果表明兩種抗H.pylori特異性IgY均有抗尿素酶活性，且SS1-IgY的效果更好。
　　4.建立H.pylori感染BALB/c小鼠模型
　　6周齡小鼠，染菌前12h禁食禁水，前10min用0.2M碳酸氫鈉灌胃處理，以0.2ml濃度為1×108cf

6、u/ml的SS1菌液灌胃，共3次灌胃，每次間隔1d。4w后根據(jù)革蘭氏染色鏡檢、PCR，快速尿酶試驗(yàn)檢測結(jié)果判定成功建立了H.pylori感染BALB/c小鼠模型。
　　5.兩種IgY在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對H.pylon的抑制作用
　　將6周齡小鼠隨機(jī)分為7組，分別為IB-IgY3mmg組，6mmg組，SS1-IgY3mmg組，6mmg組，奧美拉唑與克拉霉素聯(lián)合組，陽性感染組與生理鹽水組。與建模時(shí)相同的處理方法對實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行細(xì)菌灌胃